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免疫印迹实验步骤及问题解决
一、实验步骤
试剂和缓冲液
1x 缓冲液: 50 ， 150 ， 0.1% ， 0.5% ， 1% 100 或40.
1x 缓冲液: 137 ， 2.7 ， 2.7 24， 2.7 24， 7.4
或蛋白分析试剂盒
1.5 M 缓冲液 （ 8.8）: 90.68 g 2O， 500 溶液调节到8.8
1.0 M 缓冲液 （ 6.8）: 60.58 g 2O， 500 溶液调节到6.8
10% : 100 溶于1 2O。 用前准备
10% : 10 g 溶于100 2O。
1x 甘氨酸电泳缓冲液: 25 ， 230 甘氨酸 （ 8.3）， 0.1% 。
3x 蛋白加样缓冲液: 150 （ 6.8）， 6% ， 30% 甘油， 30 和0.2% 溴酚蓝
1x : 25 （ 7.5）: 0.15 M ， 0.05% 20， 0.001% 硫柳汞
1x 转移缓冲液: 3 g ， 14.4 g甘氨酸和200 甲醇，加2O 到1L

样品准备
细胞培养样品

贴壁细胞
去除培养基，用1X 冲洗去掉残留培养基
加入预冷的400 1 1X 缓冲液/100 平皿。 在冰上孵育5-10 。
完全刮下细胞并转移到在冰上预冷的1.5 离心管中。
（可选）充分混匀或超声处理。
4°C下12,000 离心10-15 并收集上清
总蛋白用前需储存在-20°C。

悬浮细胞
（可选）取出100 细胞培养也进行细胞计数。
将细胞转移到预冷的1.5 或15 离心管2000 4°C离心5 。
去除培养基并用1 预冷的1x 重悬细胞，然后转移到1.5 离心管中。
2000 4°C离心5 。
用1 预冷的 缓冲液/107细胞重悬细胞
细胞悬液在冰上孵育并摇床30 ，或充分混匀或超声处理。
4°C 12000 离心10-15 收集上清备用。
总蛋白需要在用前储存在-20°C 。

组织
组织准备和定量。将组织切成小块。
加入500-600 预冷的1x 缓冲液/100 组织。
将组织充分混匀
4°C 12000 离心15-20。
收集上清。
总蛋白在用前应储存在-20°C。

蛋白定量
分析和分析请查看来邦的综述 蛋白定量。

聚丙烯酰胺凝胶
615% 分离胶上注入5%的浓缩胶并插上梳子（10或者15孔）。
分离胶浓度（%）
蛋白大小范围（）
8
25-200
10
15-100
12.5
10-70
15
12-45
20
4-40
表1： 蛋白分离范围由分离胶浓度决定。

上样和电泳
2X 蛋白上样缓冲液与蛋白样品1:1充分混匀。
注胶前先将样品在50-60°C预热。预染可用于监控蛋白分离和转移效率。
在1X 甘氨酸缓冲液在60-120V跑电泳1-3小时
分离胶（10）
浓缩胶（3）

6%
8%
10%
12%
15%
6%
H20
5.3
4.6
4.0
3.3
2.3
2.1
30% 丙烯酰胺混合物*
2.0
2.7
3.3
4.0
5.0
0.5
1.5M （ 8.8）
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
1.0M （ 6.8） 0.38
10%
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.03
10%
0.1
0.1
0.1
.1
0.1
0.03

0.008
0.006
0.004
0.004
0.004
0.003
表2：分离胶（10）和浓缩胶（3）的制备方案

蛋白转移
将蛋白转移到或*膜上进行抗体检测
1.将电泳材料，如胶、纸和海绵放入1X转移缓冲液中预先浸润.
2膜应在甲醇中预先孵育10秒到1分钟，然后移入转移缓冲液中
3.将材料按如下顺序放置:板（黑色面）， 海绵， 纸， 胶， 膜， 纸， 海绵， 板（亮面）.
4.将转移装置安置好，黑色面对应黑色电极。
5.转移到冷的1X转移缓冲液中.电转电流和时间应该根据电泳装置的厂家说明推荐设置。
* 膜不能用甲醇孵育。

将膜放入溶有5%脱脂奶粉的1x 中25°C孵育1小时 （或在摇床上4°C孵育过夜）。
抗体孵育
1.按照推荐浓度或根据结果优化浓度，将一抗溶于1X 3% 中。
2.在4°C孵育过夜或更长时间，或者在室温下4小时。
3.回收一抗，保存在4°C。然后在室温下在摇床上冲洗膜三次，每次5-10 。
4.将二抗放入1X 中稀释，然后室温下孵育膜1小时，或4°C摇床上2-4小时。
5.在室温摇床上用洗三次，每次10
系统和胶卷被用于标记的二抗。

二、问题解决
没有信号，可能原因
检测的二抗用错了（明确一抗制备的宿主）
一抗或二抗的浓度太低（提高浓度再试一次）
一抗不能识别检测物种的蛋白（检查一抗的特异性）
上样蛋白量太少（增加样品的量）
转移效率太低（改进转移实验步骤。确保膜用之前用甲醇预孵育）
一抗已经被用很多次了（使用重新稀释的一抗）
封闭时间太长或者洗涤次数太多（减少封闭时间和洗涤次数）
检测试剂盒失效（加入阳性对照并确保试剂盒有效）
叠氮化钠可能抑制二抗（溶解缓冲液中应避免使用叠氮化钠）
一抗或二抗的孵育时间太短（延长孵育时间）

背景太亮
封闭时间太短或者封闭缓冲液有问题（延长封闭时间或者用代替脱脂奶粉）。
一抗或二抗浓度太高。（降低抗体浓度）
洗脱不充分（增加洗脱次数）
孵育温度太高 （确保一抗在4°C孵育）
膜使用错误或者膜已经干了 （避免膜变干）

白色条带或者信号消失很快
一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）

条带弯曲
电泳电压太高，或者电泳过程中缓冲液温度太高。（降低电压，电泳缓冲液置于冷的环境中）

条带弥散
一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）
上样蛋白量太大 （降低上样量）

空白区域
转移不均衡（确保膜均衡的贴到胶上，没有气泡）
非特异性信号
一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）

条带脏或者模糊
平衡时间不够，或者胶与膜的接触不均衡。（确保胶没问题，改进转移步骤）

秃斑
胶与膜之间有气泡（确保胶与膜之间没有气泡）

条带大小与理论不符
一抗特异性差（更换一抗）
一些蛋白可能移动与理论大小差别较大。

不能阐释可能的翻译后修饰
翻译后修饰例如多聚（核糖基）链（它能够介导蛋白分子带负电荷）不能通过分别。 不过它们能通过分开。 ， 溴化十六烷基三甲基铵 （(C16H33）N(3)3， ， ）是一种基于氨阳离子的表面活性剂。