血清肌酸激酶测和应用专家讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,试验十二 血清肌酸激酶测定与应用,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第1页,1,试验目标,了解血清肌酸磷酸激酶测定方法。,掌握其测定应用与意义。,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第2页,2,试验原理,肌酸激酶（,Creatine phosphokinase,，简称,CK,）广泛存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，肝脏和红细胞等不含此酶。骨骼肌中含量最丰富，占全身总量,96%,之多。,肌酸磷酸激酶在肌肉收缩中很主要，它催化以下反应：,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第3页,上述反应确保肌肉收缩时能量供给和运动后,ATP,和肌酸磷酸再合成。正常人血清中肌酸磷酸激酶主要由骨骼肌和心肌细胞透过细胞膜进入血液结果，其活力很小。正常值每升血液中,100,活力单位以下。,运动训练能使血清肌酸酸磷酸活性升高。其原因普通认为运动时缺氧,代谢产物积累，供能相对不足等原因，引发肌细胞膜通透性升高。或肌细胞膜受到损伤，促使,CK,从细胞内释放增加，进入血液循环，其中以肌肉牵拉机械性损伤或产生血肿等原因最为主要。,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第4页,滑雪运动和马拉松赛跑后，血清,CK,活性较高，尤其是大强度马拉松赛跑最高。在运动后,4,小时升高，,8-16,小时达最高值。跳跃、短跑等短时间激烈运动，冲击性运动，也易引发,CK,活性升高。大运动量训练和,100m,、,200m,跑比赛后，血清中,CK,活性都显著升高，尤其是在比赛时，升高更为显著。,应用肌酸磷酸激酶来作机能评定时，普通认为,2-3,天取血测定一次,在负荷后经常处于,100-200,国际活力单位,/L,。假如超出,200,IU/L,，就是运动量过大，身体还未恢复，此时应调整运动量。,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第5页,3,试验器材与试剂,器材,器材,试管、分光光度计、分析天平、采血装置（注射器）、水浴箱、离心机,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第6页,试剂,试剂,混合底物,pH 7.4,三羟甲基氨基甲烷,-,盐酸缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（,Tris,）,2.4g,，加蒸馏水至,100 ml,，再加入,0.2 N,盐酸,88.8 ml,及无水硫酸镁,0.34g,，调整,pH,至,7.4,。此液在室温下可保留数月。,0.012 M,磷酸肌酸溶液：称取磷酸肌酸钠（,C,4,H,8,O,5,-O,4,PNa,3,6H,2,O,）,4,36 mg,，加蒸馏水至,100 ml,，调整,PH,至,7.4,，保留于,-25,或普通冰箱上层冰盒中，可用一个月左右。,0.001 M ADP,溶液：称取,ADP,钠盐,0.233g,，加蒸馏水至,100 ml,，调整,PH,至,7.4,，保留于,-25,或冰箱上层冰盒中，可用一个月左右。,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第7页,临用前，取上述（,1,）（,2,）（,3,）试剂各,10 ml,混合。,在此混合底物液,30 ml,中，加入盐酸半胱氨酸,0.105g,，调整,PH,至,7.4,。此试剂最好新鲜配制，也能够保留于冰盒中。普通可放,5-7,天，若空白管光密度太高，说明有游离肌酸产生，即不能再用。,0.3 N,氢氧化钡溶液,称取氢氧化钡（,Ba(OH),2,8H,2,O,）,4.73g,，加蒸馏水使之溶解（可加热助溶），并稀释到,100 ml,。,5%,硫酸锌溶液,称取硫酸锌（,ZnSO,4,7H,2,O,）,8.82g,，加蒸馏水溶解，并稀释到,100 ml,。,上述,2,、,3,两种溶液配好后，需进行滴定，即吸收,5%,硫酸锌溶液,5 ml,，放入,50 ml,三角烧瓶中，加入酚酞指示剂,2,滴，用,0.3 N Ba(OH),2,溶液滴定至出现粉红色,30,秒钟不褪色为止。,Ba(OH),2,用量与,ZnSO,4,相等，如不相等，可稀释较浓溶液。,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第8页,标准肌酸溶液（,1.7,M,/ml,）,准确称取无水肌酸,22.3mg,，置于,100ml,容量瓶中，加蒸馏水使之溶解，并稀释到刻度，置冰箱中保留，可用数日。,双乙酰液,先配成,1%,溶液，置棕色瓶中放冰箱保留。临用时用蒸馏水稀释,20,倍。,贮存碱溶液,称取,30g NaOH,，无水碳酸钠（,Na2CO3,）,64g,，加蒸馏水使溶解并稀释至,500 ml,，室温低时可析出沉淀，此时应放于,37,水浴中待沉淀溶解后再使用。,-,萘酚溶液,称取,-,萘酚,1g,，用上述贮存碱液使溶解，并稀释到,100 ml,，此液必须新鲜配制，不然空白管光密度读数增高。,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第9页,4,试验方法与步骤,肌酸磷酸激酶显色法,肌酸磷酸激酶显色法。,测定,CK,活性原理：利用上述反应所生成肌酸与,-,萘酚和双乙酸反应，生成红色化合物。在一定范围内，红色深浅与肌酸含量成正比，与一样处理肌酸标准液比色，求得酶活力。,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第10页,加入物（,ml,）,空白管,标准管,测定管,混合底物,0.75,0.75,0.75,血清,0.1,标准肌酸,（,1.7M/ml,）,0.1,蒸馏水,0.1,置,37,水浴保温,30 min,Ba(OH),2,溶液,0.5,0.5,0.5,ZnSO,4,溶液,0.5,0.5,0.5,蒸馏水,0.5,0.5,0.5,混匀，离心,5-10 min,测定操作步骤（以下表,3-14,）：,表,3-14,单位：,ml,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第11页,上清液,0.5,0.5,0.5,-,萘酚溶液,1,1,1,双乙酰液,0.5,0.5,0.5,置,37,水浴保温,15 min,蒸馏水,3,3,3,离心35min，520nm波优点进行比色,读取各管光密度,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第12页,计算：,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第13页,肌酸磷酸激酶检测试剂盒法：,原理,ATP+,葡萄糖 葡萄糖,-6-,磷酸,+ADP,为作用酶,葡萄糖,-6-,磷酸,+NADP,+,6-,磷酸,-,葡萄糖,+NADPH+H,+,为作用酶,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第14页,器材与试剂：试管、可见光分光光度计、电子分析天平、采血装置（注射器）、水浴锅、离心机、试剂盒测定法。,如：采取中生北控生物科技股份有限企业生产肌酸磷酸激酶检测试剂盒，该试剂盒适合用于全自动，半自动生化分析仪及分光光度计测定人血清中,CK,酶活浓度。,基本参数：波长：,340 nm,，温度：,25,30,37,，比色杯光径：,1cm,。,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第15页,试剂,主要成份,试验浓度,R1,己糖激酶,(HK),3000 U/L,葡萄糖,-6-,磷酸脱氢酶,(G6PDH),U/L,ADP,2 mmol/L,AMP,5 mmol/L,Ap5A,10 mol/L,NADP,2 mmol/L,NAC,20 mmol/L,磷酸肌酸,30 mmol/L,R2,咪唑缓冲液,(pH 6.7,，,25),100mmol/L,葡萄糖,20mmol/L,原装试剂杂,2-8,避光保留，使用期,12,个月。复溶后在,2-8,可稳定,7,天，在,15-25,可稳定,12,小时。,试剂盒主要成份与浓度，见表,3-15,：,表,3-15,肌酸磷酸激酶检测试剂盒成份与浓度,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第16页,加入物（,ml,）,空白管,样品管,工作液,2.50,0.50,蒸馏水,2.50,样品,0.50,混合均匀，在,37,温育,2,分钟后，读取初始吸光度，然后在准确,1,分钟，,2,分钟，,3,分钟时分别读取吸光度，确定每分钟平均吸光度改变,A,。,表,3-16,肌酸磷酸激酶检测试剂盒操作,操作步骤：取一定量,R2,（参看,R1,瓶签）复溶,1,瓶,R1,，溶解后即为工作液。工作液预先保温至测试温度。,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第17页,计算：,CK,（,U/L,）,=,（,A,样品,/,分,A,空白,/,分）,F,F=(Vt/Vs,消光系数,)1000=8095,（,37,）,Vt=,反应总体积,Vs=,样品体积,NADPH,在,340 nm,波长下毫克分子消光系数,=6.3,参考值：男：,24-195 U/L,；女：,24-170 U/L,线性上限：,CK,活力可达,1500U/L,（,37,）,注意事项：当,A/,分大于,0.0360,（,F=4127,），,0.0190,（,F=8095,）时，样品用生理盐水稀释后重新测定，,结果乘以稀释倍数；试剂空白吸光度大于,0.6,时,勿用；血清,CK,不稳定，样品搜集后要尽快分析，在室温,4,小时，在,4 8-12,小时后，,CK,活性即要下降。,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第18页,5,注意事项,5,注意事项,红细胞中肌酸磷酸激酶活力很低，故溶血标本不影响测定结果。,混合底物,pH,要求准确。,氧氧化钡和硫酸锌要滴定至恰好等量，不然离心后会出现混浊。尤其是钡离子多时，不能完全被硫酸根去除尽，使显色混浊而影响测定结果。,肌酸磷酸激酶活力单位定义：以,1 ml,血清在,37,与底物作用,1,小时，生成,1M,肌酸为,1,个肌酸磷酸激酶活力单位。,酶活力太高时，应将血清用,Tris-HCl,缓冲液稀释后再行测定，结果乘以稀释倍数。,因,-,萘酚本身颜色不恒定，试剂空白每次深浅不一样，故不能用标准曲线工作法。,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第19页,6,思索题,6,思索题,血清,CK,活性是赛前进行机能评定一项主要指标，试述其理由。,采血时挤压组织对结果有何影响？,血清肌酸激酶测和应用专家讲座,第20页,