细胞永生化实验.pptx

正常正常细胞胞的寿命是有界限的，的寿命是有界限的，体内体内细胞胞是是这样，体外培养体外培养的的细胞也是如此。胞也是如此。细胞永生化胞永生化实验则是是针对体体外培养的外培养的细胞而建立的。胞而建立的。Hay flick界限界限Hay flickHay flick界限：体外培养的细胞，不是不死界限：体外培养的细胞，不是不死的，而是有一定寿命的，其增殖不是无限的，的，而是有一定寿命的，其增殖不是无限的，而是有一定界限，这个界限称为而是有一定界限，这个界限称为Hay flickHay flick界界限。限。在体外培养的人正常细胞在体外培养的人正常细胞,经一段时间的分裂经一段时间的分裂,就会进入一种就会进入一种生长抑制生长抑制状态状态,即即衰老期衰老期(M1(M1期期)。大多数真核生物细胞。大多数真核生物细胞(生殖细胞、生殖细胞、干细胞干细胞除外除外)都具有这种特性。都具有这种特性。经转化了的细胞可越经转化了的细胞可越过衰老期而进入另一增殖抑制状态过衰老期而进入另一增殖抑制状态,即危机期即危机期(M2M2期期),危机期的细胞开始出现退化危机期的细胞开始出现退化,并逐渐并逐渐死亡。死亡。只有只有少数细胞在一定因素的影响下少数细胞在一定因素的影响下,端粒酶被激活端粒酶被激活,以自身以自身RNA RNA 为模板合成端粒为模板合成端粒DNA DNA 来补充或延长端粒来补充或延长端粒,恢复染色体的稳定性恢复染色体的稳定性,从而从而使细胞越过危机期使细胞越过危机期,发生了永生化发生了永生化。什么是细胞永生化？什么是细胞永生化？细胞永生化细胞永生化是指体外培养的细胞经过是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离老危机中逃离,从而从而具有无限增殖能具有无限增殖能力力的过程。的过程。正常细胞的增殖能力有限正常细胞的增殖能力有限,经过一定时经过一定时间的增殖后间的增殖后,最终会进入一种最终会进入一种生长抑生长抑制制状态状态,而一些肿瘤细胞可以无限增而一些肿瘤细胞可以无限增殖。殖。细胞永生化意义细胞永生化意义了解细胞增殖与衰老的分子机制了解细胞增殖与衰老的分子机制及及保保存一些重要疑难病例的样本存一些重要疑难病例的样本。为治疗肿瘤、为治疗肿瘤、控制肿瘤细胞的增殖以控制肿瘤细胞的增殖以及器官移植的研究奠定了坚实的基础及器官移植的研究奠定了坚实的基础。由于永生化细胞具有可以多次传代的由于永生化细胞具有可以多次传代的这一特性这一特性,我们可以我们可以利用各种细胞永利用各种细胞永生化的方法使那些生化的方法使那些传代困难传代困难、增殖慢增殖慢、易衰老易衰老的细胞获得永生的细胞获得永生,从而提供更多从而提供更多的细胞资源。的细胞资源。EB EB 病毒转化人类外周血病毒转化人类外周血B-B-淋巴淋巴细胞建立永生细胞系细胞建立永生细胞系EB EB 病毒病毒 (epstein barr virus)(epstein barr virus)转转化外周血化外周血B B 淋巴细胞淋巴细胞(B-LC),(B-LC),使其成使其成为一种能连续分裂永久生存的类淋巴母为一种能连续分裂永久生存的类淋巴母细胞细胞 (lymphoblastoid),(lymphoblastoid),由此建立由此建立的类淋巴母细胞株即为的类淋巴母细胞株即为永生细胞株永生细胞株 (immorta1ized cell lines),immorta1ized cell lines),它它可永可永远传代远传代,并且每一种永生细胞株保存了并且每一种永生细胞株保存了原来提供血样个体的完整基因组原来提供血样个体的完整基因组,而且而且它的生化和分子生物学特性不发生变化它的生化和分子生物学特性不发生变化,可作为生物标本库建立的首选方法可作为生物标本库建立的首选方法。利用利用EBEB病毒转化外周血病毒转化外周血B-B-淋巴细胞建立淋巴细胞建立精神发育迟滞永生细胞库精神发育迟滞永生细胞库,或各种疾病或各种疾病,特别是罕见疾病永生细胞库已成为当今特别是罕见疾病永生细胞库已成为当今永久保存全基因组的永久保存全基因组的首选方法首选方法,它可为它可为精神发育迟滞及其它罕见疾病的遗传流精神发育迟滞及其它罕见疾病的遗传流行病学、临床遗传学、分子生物学等研行病学、临床遗传学、分子生物学等研究提供永久性试验材料。究提供永久性试验材料。EBEB病毒的特征之一是病毒的特征之一是对对B B细胞有天然的细胞有天然的亲和力并使其发生转化亲和力并使其发生转化,EBV,EBV引起的是一引起的是一种无休止的细胞分裂和种无休止的细胞分裂和 DNA DNA 的无限的的无限的合成。合成。此外此外,EBV,EBV 在体外对在体外对B B细胞的细胞的转化效率转化效率很高很高,一般都能达到一般都能达到80%-100%80%-100%。因为上。因为上述特点述特点,世界上许多遗传研究中心都用世界上许多遗传研究中心都用此方法作为常规处理每一份血标本此方法作为常规处理每一份血标本 ,建立人类遗传种质库。建立人类遗传种质库。病毒转化后的病毒转化后的B B淋巴母细胞样细胞系淋巴母细胞样细胞系(B-LCLs)(B-LCLs)依然保存了依然保存了B B细胞的分化特征细胞的分化特征和免疫表型和免疫表型，作为抗原递呈细胞，它，作为抗原递呈细胞，它可以摄取加工抗原，并将其载体部分可以摄取加工抗原，并将其载体部分表达于细胞表面，供表达于细胞表面，供T T细胞受体识别；细胞受体识别；也可也可作为抗体基因的来源作为抗体基因的来源，将其与骨，将其与骨髓瘤细胞融合，制备分泌相应的单克髓瘤细胞融合，制备分泌相应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。隆抗体的杂交瘤细胞株。Epstein-BarrEpstein-Barr病毒病毒(EBV)(EBV)是是19641964年首先从非年首先从非洲恶性洲恶性BurkittBurkitt淋巴瘤淋巴瘤(BL)(BL)的淋巴母细胞系的淋巴母细胞系中发现的，属疱疹病毒科中发现的，属疱疹病毒科亚科。亚科。EBVEBV有一有一个与其他个与其他DNADNA病毒不同的特点，就是它在体病毒不同的特点，就是它在体外对外对B B细胞的感染可刺激细胞的持续性生长细胞的感染可刺激细胞的持续性生长并引起细胞的永生化，从而形成淋巴母细并引起细胞的永生化，从而形成淋巴母细胞样细胞系胞样细胞系(1ymphoblastoid cell lines(1ymphoblastoid cell lines，LCLs),LCLs),尤其对人二倍体淋巴细胞转化效尤其对人二倍体淋巴细胞转化效果极佳。果极佳。EBVEBV主要通过主要通过结合结合人类人类B B淋巴细胞膜上的淋巴细胞膜上的EBEB病毒病毒受体受体而感染而感染B B淋巴细胞，初次受到感淋巴细胞，初次受到感染便被迅速致敏，染便被迅速致敏，36h36h后就可有后就可有DNADNA合成。合成。被感染的被感染的B B细胞在细胞在EBEB病毒核抗原的刺激下病毒核抗原的刺激下转化为转化为类淋巴母细胞类淋巴母细胞，其端粒酶活性提高，其端粒酶活性提高，维护了细胞染色体端粒长度的稳定，并能维护了细胞染色体端粒长度的稳定，并能够不断分裂增殖，从而促使够不断分裂增殖，从而促使B B淋巴细胞的淋巴细胞的永生性生长。永生性生长。转化的细胞株染色体稳定，转化的细胞株染色体稳定，保留了原有的遗传性状保留了原有的遗传性状。人淋巴细胞转化。人淋巴细胞转化是建立永生细胞系及进行细胞遗传和分子是建立永生细胞系及进行细胞遗传和分子遗传研究的极好方法。遗传研究的极好方法。实验材料和方法试剂试剂产生产生 EBV的的 B95-8细胞株，细胞株，RPMI1640培养基，培养基，PBS缓冲液，胎牛缓冲液，胎牛血清，淋巴细胞分离液，血清，淋巴细胞分离液，环孢霉素环孢霉素A，植物凝集素，台盼蓝染液植物凝集素，台盼蓝染液标本的收集标本的收集取样：取样：无菌无菌、轻轻摇动使血液与肝素混匀、轻轻摇动使血液与肝素混匀秦巴山区精神发育迟滞患者家系（秦巴山区精神发育迟滞患者家系（两天两天之内的血样之内的血样）实验方法方法EB病毒的制病毒的制备EBEB病毒基因组序列及其表达研究主要是病毒基因组序列及其表达研究主要是用用B95-8 B95-8 株株进行的进行的,B95-8 B95-8 细胞系是用传细胞系是用传染性单核细胞增多症患者的染性单核细胞增多症患者的EB EB 病毒感染病毒感染绒猴绒猴B B 淋巴细胞建立的淋巴细胞建立的。在。在B95-8 B95-8 细胞细胞系中只有很少一部分细胞可以自发产生系中只有很少一部分细胞可以自发产生病毒病毒,其他细胞呈隐性状态其他细胞呈隐性状态,用不同的用不同的诱生剂如诱生剂如TPATPA诱生后诱生后,使产生病毒的细胞使产生病毒的细胞明显增加。明显增加。B95-8B95-8在在EBEB病毒转化病毒转化B-B-淋巴细淋巴细胞过程中非常重要胞过程中非常重要,通过培养通过培养B95-8B95-8细胞细胞制备出大量高效价的制备出大量高效价的EBEB病毒液病毒液,对于对于B95-8B95-8细胞的培养质量细胞的培养质量是是EBEB病毒转化病毒转化B-B-淋淋巴细胞成败的巴细胞成败的关键关键。复苏复苏B95-8B95-8细胞株，加入无血清细胞株，加入无血清RPMI-RPMI-16401640培养液，培养液，1000r/min1000r/min离心离心10min,10min,弃弃上清，加入完全上清，加入完全RPMI-1640RPMI-1640培养液培养液(含含1010FBSFBS，含，含PenPenStrep)Strep)，每，每2-3d2-3d半半量加液一次，待细胞数达到量加液一次，待细胞数达到lxl0lxl06 6mLmL时，饥饿细胞时，饥饿细胞4-7d4-7d后，收集上清液，后，收集上清液，-7070及及3737反复冻融反复冻融 3 3 次次 ,再转移至再转移至离心管中离心管中 ,2000r/min,2000r/min 离心离心 15min15min，将上清液用将上清液用 0.22 m 0.22 m 滤膜过滤后分滤膜过滤后分装至装至 1.5mlEpendof 1.5mlEpendof 管中管中 ,平均平均 1.2ml/1.2ml/管管 ,-80 ,-80 保存。保存。淋巴细胞EBV转化法（1）将血）将血样静置静置30分分钟，期，期间进行下一步行下一步实验。（2）冰箱中取出）冰箱中取出4避光保存的淋巴避光保存的淋巴细胞分胞分离液。离液。摇匀后在无菌状匀后在无菌状态下取下取4mL加入刻度加入刻度离心管中，离心管中，37水浴中平衡。水浴中平衡。（3）PBS缓冲液将血冲液将血样1:1稀稀释混匀（混匀（各各3mL）。）。（4）将稀）将稀释的血液沿离心管壁的血液沿离心管壁徐徐徐徐加到分离加到分离液液面上。液液面上。（5）室温下）室温下2000r/m离心离心20m。2000rpm,30minPBMC红细胞、粒红细胞、粒细胞细胞稀释的血浆、稀释的血浆、血小板血小板FicollFicoll（6）吸出淋巴）吸出淋巴细胞上方胞上方2-3mm的透明血的透明血浆。将吸管。将吸管轻轻沿离心管周沿离心管周缘吸出血吸出血浆层与分离液与分离液层界面界面间的的白膜白膜层细胞胞，以及它下面一半的淋巴，以及它下面一半的淋巴细胞分离液，胞分离液，然后然后转移到另外一个离心管中。移到另外一个离心管中。（7）洗）洗涤 充分混匀后，充分混匀后，2000r/m离心离心10m。沉淀。沉淀经PBS缓冲冲液吹打清洗。吹打均匀后液吹打清洗。吹打均匀后对细胞胞进行行计数数。计数方法数方法如下：取如下：取5L洗洗涤液与液与5 L 1%台盼台盼蓝染色染色液在小离心管液在小离心管混合均匀混合均匀，将其吸出置于，将其吸出置于计数板数板上于上于倒置倒置显微微镜下下检测细胞活力（胞活力（应大于大于95%），并），并计数数细胞。通常，每毫升外周血可得胞。通常，每毫升外周血可得1 106 2106个个 PBMC。在染色期。在染色期间可可对细胞胞进行行第二次洗第二次洗涤操作，操作，首先吸出离心管内的首先吸出离心管内的PBS缓冲液，然后再加入新的冲液，然后再加入新的PBS缓冲液，冲液，2000r/m离心离心10m。管内沉淀即。管内沉淀即为所所需需细胞。胞。（8）分离的淋巴）分离的淋巴细胞胞悬于于1mL含含EBV的上的上清，密度清，密度为2 106/mL，T25组织培养瓶培养瓶中中垂直放置垂直放置于于CO2培养箱培养箱3h孵育。孵育。（9）培养）培养 2000r/m离心离心10m，5mL RPMI 1640完全培完全培养液重养液重悬，加入，加入终浓度度为0.2g/mL的的环孢霉素霉素A，充分混匀后等量移入，充分混匀后等量移入T25组织培养瓶内，置于培养瓶内，置于37，5%CO2培养箱培培养箱培养。待液体养。待液体稍黄稍黄，补加加2mL完全培养基。完全培养基。（10）冻存与复存与复苏 将培养好的将培养好的细胞胞进行行冻存，之后存，之后过一段一段时间进行复行复苏，并，并检测细胞活力。胞活力。实验结果果1、LCLs的光的光镜下形下形态 接种后接种后715 d，培养板内可以看，培养板内可以看见有有细胞胞体体积增大增大、变形呈形呈梭状梭状；细胞胞变透亮透亮，开始出，开始出现细胞分裂、聚胞分裂、聚团，大，大约23周开始形成周开始形成细胞克隆胞克隆团。以后，。以后，随着随着细胞分裂增生，胞分裂增生，细胞数量不断增胞数量不断增多，多，细胞克隆胞克隆团不断增大，呈不断增大，呈悬浮式浮式生生长，高倍，高倍镜下可下可见细胞胞团边缘有有毛毛 刺状突起刺状突起。1d4d7d20d30d2、染色体核型分析、染色体核型分析 G带分型分型 染色体染色体显带是将染色体是将染色体标本本经过一定一定程序程序处理，并理，并用用特定染料染色特定染料染色，使，使染色体沿其染色体沿其长轴显现明暗或深明暗或深浅相浅相间的横的横纹染色体染色体带，这种技种技术，称，称为染色体染色体显带技技术。通。通过显带，人，人们可以可以准确地准确地识别每一条每一条染色体及染色体上的各个区段，并可染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上染色体上较细微的微的结构构变化。化。在所有的在所有的显带技技术中，中，G显带（G banding）是最常）是最常见的的显带技技术，它是将染色体，它是将染色体标本用碱、胰蛋白本用碱、胰蛋白酶或其它或其它盐溶液溶液处理后，再用理后，再用Giemsa染液染液染色，在普染色，在普通通显微微镜下，可下，可见深浅相深浅相间的的带纹，称，称G带（G band）。）。G显带方法方法简便，便，带纹清晰，染色体清晰，染色体标本本可以可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和断和研究。研究。3、病毒基因病毒基因检测开放开放阅读框框潜伏基因潜伏基因EBNA蛋白家族蛋白家族LMP蛋白家族蛋白家族非多聚腺苷非多聚腺苷酸化的小酸化的小RNA大部分潜伏蛋白的大部分潜伏蛋白的表达表达对于于B细胞的有效永生化是必需的胞的有效永生化是必需的潜伏潜伏膜蛋白膜蛋白l（LMP1）潜伏膜蛋白潜伏膜蛋白1（LMP1）是）是EBV在在潜伏状潜伏状态时表达表达的蛋白的蛋白质，在在许多多EBV相关的疾病及相关的疾病及肿瘤中表瘤中表达，达，是众多是众多EBV编码蛋白中被明确蛋白中被明确证明能明能恶性性转化化鼠鼠纤维母母细胞胞、B细胞和人上皮胞和人上皮细胞胞的蛋白，的蛋白，LMP1促促转化致瘤作用机制其化致瘤作用机制其实非常复非常复杂需需进一一步步阐明，尤其是目前明，尤其是目前对LMP1与宿主蛋白与宿主蛋白间的相的相互作用知之甚少。互作用知之甚少。LMP1缺失的缺失的EBV重重组体不再能体不再能转化化B细胞，胞，说明明LMP1对于于细胞的胞的转化是必不可少化是必不可少的。的。具体操作提提总RNA反反转录合成合成cDNAPCR扩增增cDNA琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳4 4、流式、流式细细胞胞仪检测细仪检测细胞周期胞周期变变化化 以及以及细细胞表面胞表面标记标记CD19、CD20是所有是所有成熟成熟B细胞胞共有的共有的表面表面标志，志，只在只在B淋巴淋巴细胞表面胞表面表达，表达，B细胞活化后亦不消失。因此可胞活化后亦不消失。因此可选择FITC标记的抗人的抗人CD19/CD20对LCLs进行行检测。B淋巴母淋巴母细胞永久胞永久细胞系建系平均需胞系建系平均需要四周左右，期要四周左右，期间用流式用流式细胞胞术检测转化后化后LCLs细胞膜表面分子胞膜表面分子CD19、CD20的表达，可的表达，可鉴定定转化后化后细胞的表胞的表型，以型，以确确认LCLs是否起源于是否起源于B细胞胞。