confocal原理本科生实验02.pptx

激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜原理及应用原理及应用2009年年10月月Confocal 原理及应用Confocal 原理什么是Confocal？LSCM（Laser Scanning Confocal Microscope）激光扫描共聚焦显微镜1955年，Marvin Minsky为了观察活体脑组织中的神经网络，首次提出了共聚焦显微镜的基本原理1）激光作光源；2）扫描成像；3）共聚焦光路设计；4）荧光显微镜Confocal 原理荧光显微镜落射荧光光路 (EPI Fluorescence Optics)Confocal 原理激光光源激光光源具有如下优点：1）单色光；2）高强度；3）方向性好（点光源）；4）偏振光多线氩离子激光器 (457，477，488，514nm)氦氖激光器 (543，594，633nm)固体激光器（408，488，561，640nm）Confocal 原理激光光源激光器Confocal 原理扫描成像LSCM采用逐点成像方式，通过软件重建出完整视野采用X，Y扫描振镜精确控制激光点的位置，对整个视野进行扫描Confocal 原理Confocal光路针孔的采用，是Confocal光路的关键所在Three PointsA point light source for illuminationA point light focus within the specimenA pinhole at the image detecting plane针孔正好位于物镜焦平面上的点 所成像的位置；针孔起到一个很好的“过滤”作用，挡掉来自非焦平面上信号的干扰Confocal 原理Confocal光路PMTConfocal 原理PMTPMTConfocal光路PMTConfocal 原理Confocal光路PMT原理Confocal 原理Photomutiplier TubeConfocal 原理PMT原理通过衍射形成图像。在物镜共轭平面探测图像。分辨率和对比度由相同的因素决定。显微镜的光学装置的选择标准相同。像差对图像的影响相同宽场图像在整个视场同时形成，共聚焦显微镜图像是一个像素一个像素进行扫描获得的。宽场图像在图像平面成一实像。共聚焦图像只是暂时存在于图像共轭平面。共聚焦图像在空间上通过共聚焦针孔来过滤。相似点相似点不同点不同点Confocal 原理confocal 和普通显微镜的异同点Confocal 原理Confocal和普通宽场荧光图像比较Confocal 原理Confocal和普通宽场荧光图像比较Confocal 原理Confocal的优点Confocal 原理Nikon C1Si所采用的技术Confocal 软件界面整体Confocal 软件拍摄界面选择激光选择探测通道设定扫描分辨率预览（图像连续更新）调节焦距，设定扫描区域调节针孔调节象素扫描时间调节每个通道的增益调节激光强度Confocal 软件激光波长选择408 nm Dapi,Cascade Blue,BFP,CFP440 nm CFP,Fura Red,Lucifer Yellow488 nm GFP,Alexa 488,FITC,DiO 514 nm YFP,TOTO-1,Calcium Green543 nm DS Red,Cy3,TRITC,DiI 594 nm Alexa 594,Texas Red640 nm Cy5,TOPRO-3,DRAQ-5Confocal 软件得到最佳图象效果通过调节通过调节Gamma,饱和度饱和度,和和dark level，使图像显示和伪彩色显示相匹配使图像显示和伪彩色显示相匹配,得到最佳图像显示质量得到最佳图像显示质量.Confocal 软件Z stack序列图象软件可以根据物镜选择最佳步径。在您想要拍摄的stack范围内选择一个切面，得到优质图象。选择感兴趣范围选ref，点红色按钮设置参考位置调节焦距，设置顶部和底部位置，注意过饱和指示，优化增益值选择Z-stack必要时选择Average提高信噪比调节分辨率点single获取Z-stack图象Confocal 应用应用分类Confocal的应用大致可以分为3类：1）常规应用：这类应用通过普通荧光显微镜）常规应用：这类应用通过普通荧光显微镜 也可以实现，但也可以实现，但Confocal要做的要做的 更好或者好得多；更好或者好得多；2）专有应用：这类实验利用了Confocal专有的 特性；3）光谱应用：利用Confocal的光谱特性设计 实验Confocal 应用常规应用利用Confocal进行空间定位：1）免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位如：细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位；2）细胞凋亡机制；3）荧光原位杂交,杂色体基因定位；4）细胞骨架装配：分析正常及癌变细胞中细胞骨架与核改变之间的关系；5）细胞黏附行为Confocal 应用常规应用多个荧光通道的叠加：Confocal 应用常规应用荧光通道和DIC通道的叠加：Budding yeast cellsExpressing a fusion of GFP(S65T,V163A)to the endoplasmic reticulum membrane protein SEC63pConfocal 应用常规应用3D重建和分析：Confocal 应用常规应用3D重建和分析：A retinal ganglion cell Confocal 应用常规应用活细胞动态记录：1）分子的运动；2）细胞的增殖分裂；3）细胞突起的运动；4）细胞、组织的生长发育神经元生长锥倾向于向AchR的方位生长J Neurosci.2006 Jan 18;26(3):934-47 Confocal 应用常规应用多维记录：1）XYZT；2）XYZ入；3）XYZT入；4）XYZT多点拍摄；5）XYT入Confocal 应用常规应用定量测量：1）活细胞或组织内游离Ca2+浓度的测量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)；2）活细胞内H+浓度（pH值）的测量；3）自由基的检测；4）药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量；5）荧光共振能量转移（FRET）Pseudocolored images of changes in intracellularfree Ca2+in AtT-20/D16v-F2 cells,monitoredat 9-second intervals with fluo-4,AMConfocal 应用常规应用定量测量：Fast confocal recording of spontaneous Ca2+sparks in a rat ventricular myocyte.Single myocytes were isolated from rat hearts andloaded with fluo-4,AMCLSM使用技术要点 样品的准备 样品的荧光标记 LSCM的基本操作样品准备 样品的最大厚度大约12mm(10/0.4 物镜),它取决于物镜的数值孔径(NA)、物镜的工作距离、激光的穿透力以及样品的透明度。一般要求是单层贴壁细胞,可以是经荧光探针标记(单标、双标、三标)固定的或活的组织、固定的或活的贴壁培养细胞、用盖玻片封片的经甩片或滴片后的悬浮细胞。对于非贴壁细胞的粘贴,一般常用的粘贴剂有多聚赖氨酸伴刀豆球蛋celltakvectabond琼脂凝胶等。选择粘贴剂的标准是:不影响实验目的,对标本无损害.样品荧光标记 荧光探针的选择:一般情况下应根据研究目的、研究方法、所用机器类型选择合适的荧光探针种类和商品形式。如需要进行两种以上的荧光标记时,应当注意这两种荧光探针的性质:如激发波长是否可以分开,颜色是否相同,对环境温度的敏感性等。荧光探针的负载:染色过程的一般原则是在保证一定信噪比的前提下,尽量降低所用荧光染料的浓度,消除其对待测离子的缓冲作用。根据荧光染料的不同,一般可采用孵育显微注射转基因或经膜片钳微电极尖端导入细胞等方法进行负载。胞内染料浓度及分布由细胞的生理参数及具体的实验条件决定.对于不同的样品,荧光探针的负载条件应在不断探索中完善.CLSM基本操作显微镜的基本操作：激光共聚焦系统的开关：用LSCM扫描三种图像（XY,XYT,XYZ以及XY）二维图像的扫描3D图像的构建时间序列扫描作作 业业1、描述confocal结构特点及成像原理？2、如何理解共焦针孔的滤过作用？3、confocal 和普通显微镜的异同点？4、简述confocal在生物学上的应用？5、列举几种常用的荧光探针/染料?(可查资料)结束谢谢！谢谢！