细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,细胞生物学实验 张 伟,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,细胞生物学实验 张 伟,*,细胞生物学试验 张 伟,1.细胞培养中为何NaHCO,3,？,2.细胞培养中为何添加血清？,3.消化液胰酶浓度是多少？,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第1页,细胞生物学试验 张 伟,一、试验原理,（一）传代培养,1.传代培养概念,当原代培养细胞或已成为细胞系细胞，增殖到达一定密度后，将培养细胞从一个容器以适当比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，称为传代培养或继代培养。,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第2页,细胞生物学试验 张 伟,2.细胞传代意义与目标,预防细胞增殖过分、营养枯竭、酸中毒,维持细胞种,延续,。,利用培养细胞,进行各种试验,。,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第3页,细胞生物学试验 张 伟,传代中“代”与细胞世代中“代”不一样,传代频率或间隔与培养液性质、接种细胞数量和细胞增殖速度相关。,3.需要注意两个问题,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第4页,细胞生物学试验 张 伟,（,二）培养细胞种类,贴壁细胞,：,附着在一个固相支持物表面才能生长细胞。如大部分上皮起源细胞。单层细胞，接触抑制。,半贴壁细胞,：,展现贴壁生长现象，但不牢。,悬浮细胞,：,不需附着在固相支持物表面，悬浮即可生长细胞。如血细胞等。,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第5页,细胞生物学试验 张 伟,贴壁细胞,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第6页,细胞生物学试验 张 伟,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第7页,细胞生物学试验 张 伟,悬浮型细胞。,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第8页,细胞生物学试验 张 伟,半贴壁细胞,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第9页,细胞生物学试验 张 伟,（三）细胞贴壁过程,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第10页,细胞生物学试验 张 伟,（,四）细胞传代后四个生长阶段,潜伏期,：细胞无分裂，6-二十四小时。,指数生长久,：细胞增殖最旺盛时期，分裂相细胞百分比（分裂指数）。,停滞期,：细胞数量到达饱和，细胞停顿增殖，但仍有代谢活动。平台期。,衰退期,：自然衰退和耗竭衰退,。,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第11页,细胞生物学试验 张 伟,培养细胞一代生长过程,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第12页,细胞生物学试验 张 伟,（五）何时传代与怎样传代？,1.肉眼观察,培养物颜色及混浊度,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第13页,细胞生物学试验 张 伟,2.倒置显微镜观察细胞生长状态,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第14页,细胞生物学试验 张 伟,贴壁生长细胞传代,弃掉培养液，加0.51mL胰酶涮洗一下培养瓶，去残留旧培养液，解除血清对胰酶抑制作用。,每瓶细胞加入1mL胰酶,盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞突起收回变圆时马上翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶去掉。注意勿使细胞提早脱壁落入消化液中。,加入5ml含血清新鲜培养基，重复吹打消化好细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液计数然后分装到新培养瓶中(1x10,5,/ml，5mL/小瓶）。盖上瓶盖,适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体进入，将培养瓶放回CO2培养箱。,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第15页,细胞生物学试验 张 伟,细胞消化最正确程度,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第16页,细胞生物学试验 张 伟,悬浮细胞传代步骤,可将细胞培养悬液进行离心去除旧培养液上清，加入新鲜培养液，然后分装到各瓶中。,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第17页,细胞生物学试验 张 伟,意义：,为了保留细胞，尤其是不易取得突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存（保种）。运输等,条件：,冻存温度普通用液氮温度196，短时间能够存放在-80。,冻存液,：普通为含10%二甲亚砜（DMSO）或甘油培养基,(六)细胞冻存,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第18页,细胞生物学试验 张 伟,冷冻保护剂种类及作用机制,惯用渗透性冷冻保护剂主要包含,甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇,等。,DMSO：对细胞无毒性，分子量小，溶解度好，能快速透入细胞，降低冰点，提升细胞膜对水通透性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结之前透出细胞外，在胞外形成冰晶，提升细胞内电解质浓度，降低胞内冰晶，从而降低冰晶对细胞冻伤。惯用浓度为5%-10%，细胞在液氮中冻存1-2年，存活率可达80%-90%。DMSO液需预先用培养液配好，防止因暂时配制产热而伤害细胞,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第19页,细胞生物学试验 张 伟,二、试验目标,掌握无菌操作技术。,掌握传代细胞培养方法与步骤。,掌握培养细胞消化方法。,了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞形态和生长情况。,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第20页,细胞生物学试验 张 伟,三、试验材料及设备,1.细胞,人宫颈癌HeLa 细胞,人胃癌BGC-823细胞,中国仓鼠卵巢CHO细胞,2.试剂,DMEM培养基、胰酶、血清、DMSO、抗生素,3.仪器,超净工作台、CO,2,培养箱、倒置相差显微镜,4.其它用具：,培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75酒精棉球，酒精灯,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第21页,细胞生物学试验 张 伟,四、试验步骤,1,.准备,：超净工作台紫外线处理30分钟,用肥皂洗手,穿鞋套，用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。,2.倒置显微镜下,观察细胞形态,，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释倍数。,将培养用液置37C预热。,3关闭超净台紫外灯,打开可见光灯开关,打开抽风机清洁空气，除去臭氧。用75%酒精擦双手消毒。,4.,正确摆放超净台内试验用具,：酒精灯、酒精棉球、新洁尔灭纱布、试管架、滴管筒（头）、吸管筒（头）、废液缸等。点燃酒精灯，准备好试验试剂：DMEM培养基（其中血清含量10%）、血清、胰酶等。,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第22页,细胞生物学试验 张 伟,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第23页,细胞生物学试验 张 伟,5.,点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。,6.将培养液瓶（90mL)过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁架子上。,7.打开血清瓶（10.5mL)，瓶口过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁架子上。,8.无菌吸收,10mL血清,加入,到培养液（90mL),中，用微量移液器加入双抗,200,L,轻轻混匀，配置完全培养基。,9.在,血清中（剩下0.5mL,)加入,4mL,完全培养基轻轻混匀，加入,0.5mL,DMSO（冻存保护剂），轻轻混匀即为冻存液。,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第24页,细胞生物学试验 张 伟,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第25页,细胞生物学试验 张 伟,10.,细胞瓶口靠近火焰打开瓶盖并在酒精灯上烧口消毒，倒掉或吸出培养基（对于小口培养瓶可采取倾倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出）,11.,加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞,，弃胰酶，再,加入一滴管或两滴管胰酶（以盖住细胞量为准),，转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，盖好瓶盖。,12.显微镜下观察细胞消化状态，,待细胞大部分收缩、突起、变圆，细胞边界清楚时，即可立起或翻转培养瓶停顿消化,，在超净台内靠近火焰处弃胰酶.,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第26页,细胞生物学试验 张 伟,13.,加两滴管（约1.8-2mL）,冻存液既,全方面吹打细胞,瓶壁,吹打均匀，细胞浓度宜大，310,6,个/mL左右。,将细胞悬液吸至冻存管中,，拧好盖，封好胶布，并,标识好细胞种类，冻存时间,，保留条件以及冻存者姓名等（悬浮细胞冻存将细胞离心后再加冻存液）,在培养瓶(残余少许细胞）中加入,5mL完全培养基,及，盖好瓶盖（拧紧后并旋回半圈）。做好统计，倒置相差显微镜下观察细胞形态，放入CO2培养箱培养。,冻存管在,4度存放30min,，转放到,20度 1.52h,，再转到,70度412h,后即可转移到,液氮,内，注意做好冻存统计,。,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第27页,细胞生物学试验 张 伟,把握好传代时机，80-90%汇合度阶段最好，过早细胞产量少，过晚细胞健康状态不佳,消化时间要适度，过短细胞不易脱落，过长细胞可脱落流失。,消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。不一样细胞对消化反应不一样。,贴壁不牢,直接吹下,细胞损伤,注意事项,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第28页,细胞生物学试验 张 伟,1.试述传代培养步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤?,2.细胞胞传代培养目标是什么?,3.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不一样?,4.怎样预计是否传代和传代方式?,5.细胞冻存应注意问题。,思索题,细胞生物学实验课细胞传代和冻存专家讲座,第29页,