生化基础知识.pptx

1临床生物化学和生物化学检验h研究健康和疾病时的生物化学过程，测定体液或组织的成分以提供对疾病的诊断、治疗和预防有用信息的一门学科。现在还包括研究治疗效果的检测。h研究领域广泛，与临床医学、计算机等联系密切。2生物化学的研究领域之一h机体代谢稳定态：生物机体是一个开放的稳态系统，它的成分随膳食、运动和生物节律性等因素影响而处于动态平衡状态。某些物质易于交换，而另一些物质可能以贮存形式为主。物质在细胞内同时进行合成代谢和分解代谢，通过进入和排出间的动态平衡维持各成分的恒定，保证机体处于健康状态。3生物化学的研究领域之二h机体稳定态紊乱所引起疾病的生物化学改变。h原因很多：1创伤或入侵因子的破坏，包括病原微生物、病毒和毒素2重要酶的遗传缺陷3一种或多种营养物质如氨基酸、维生素或矿物质的缺乏4血液供应障碍5氧气供应不足6代谢产物堆积7细胞识别某些信号的缺陷8恶性疾病9调节系统紊乱4举例说明h糖尿病主要紊乱是胰岛素活性不足，葡萄糖不断从肝细胞中释放但不能顺利进入肌细胞进行分解代谢。葡萄糖进入血浆的速率大于离开速率，血糖浓度升高。h健康人尿液中排泄的白蛋白量很少，由于肾小球的滤过作用和肾小管的重吸收作用处于平衡状态。肾病综合征时肾小球滤过的白蛋白量增多，远超过肾小管的重吸收能力，出现明显的白蛋白尿。由于机体合成白蛋白能力有限，最终引起血浆白蛋白降低。5临床生化发展的3个阶段h1910-1930年：方法学有重要进展。包括静脉穿刺技术，目视比色计的应用。h1930-1950年：40年代对疾病生化知识的积累。钾钠分析、光电比色计的应用。许多复杂实验室从基础研究学科转到临床实验室，如层析、电泳、同位素技术等。h1950年以后：自动生化分析仪问世，极大提高了工作效率，同时临床医生对实验室工作的依赖性迅速增加，申请的检验项目的种类、数量和频率猛增。6检验科生化室的功能h分析体液中各种成分的组成和浓度。某种物质的浓度明显异常，提示什么地方出现了障碍。h血浆中某种物质的浓度升高原因很多，如摄入过多、合成增加、细胞过多破坏、利用不充分、排泄障碍或严重脱水等。h疾病早期阶段，症状模糊，血液成分的变化很小。此时，要求实验操作有较高的精密度和有效的质量控制（以后的将作专题讲解）来确保结果的准确性。7生化反应原理8生化反应原理h生化分析仪是临床诊断常用的重要仪器。它是通过对血液和其他体液的分析来测定各种生化指标，如胆固醇、葡萄糖、淀粉酶等。同时结合其他临床资料进行综合分析，帮助临床医生诊断疾病，并可鉴别并发因子以及决定以后治疗的基准等。h如何检测：利用光学。9h许多化学物质具有颜色（如高锰酸钾溶液），有些无色的化合物也可以和显色剂作用而生成有色物质。事实证明，当有色溶液的浓度改变时，颜色的深浅也随着改变。因此，可以通过比较溶液颜色深浅来确定有色溶液的浓度，对溶液中所含的物质进行定量分析。10h物理学告诉我们，光具有波动和微粒两种性质，称光的波粒二象性。h光是一种电磁波，可以用振动频率（）、波长（）、速度（c）、周期（T）来描述它。h在辐射能量时，光是以单个的、一份一份的能量（E=h）的形式辐射的。式中h是普朗克常量。同样光被吸收时，其能量也是一份一份被吸收的。不同波长的光子具有不同的能量。波长越短，即频率越高，能量越大。11各种色光的近似波长范围波长范围颜色10001-1000000远红外线2501-10001中红外线761-2500近红外线621-760红591-620橙561-590黄501-560绿481-500青431-480蓝401-430紫191-400普通紫外线1-191真空紫外线12光的互补及有色溶液的显色原理h我们日常所见的白光是混合而成的复合光。h若把两种颜色的光按一定比例混合，能够得到白光的话，这两种颜色的光就称为互补色。13黄黄橙橙红红紫紫蓝蓝青蓝青蓝青青绿绿白光白光互补色光示意图14h物质颜色与光的吸收、透过、反射有关。透明物质的颜色就是它透过光波的颜色。不透明物质的颜色是其反射光波的颜色。h有色溶液对光的吸收是有选择性的。实践证明，溶液所呈现的颜色是它的主要吸收光的互补色。15举例说明h一束白光通过高锰酸钾溶液时，（绿）光大部分被吸收，其他的光透过溶液。透过的光中除（紫）色外其他颜色的光两两互补，所以高锰酸钾溶液呈（紫）色。16h对于任何一种有色溶液，在某一特定波长下会有一个最大吸收值。h浓度不同的同一种溶液，其吸收光谱的形状和最大吸收波长是一样的。即不同的物质都具有特定的吸收光谱。h由于有色溶液对光的吸收有原则性，在进行比色测定时，要用只能被有色溶液吸收的光，也就是说要用单色光。（以后讲到的滤光片就是起这个作用）17波长选择18h当一束平行光照射到均匀的溶液时，光的一部分被吸收（I a),一部分反射Ir，一部分透过It。假设入射光的强度为Io，那么Io=I a+Ir+Ith实际比色分析时，所有比色皿都是同质料、同规格的，因此Ir定值。h比色分析中，常把透过光的强度占入射光的强度的百分比It/Io）%称为透过率。19色比分析理论：朗伯比尔定律A=lg IA=lg I0 0/I=a/I=a b b c c A A：吸光度吸光度吸光度吸光度 a a：摩尔消光系数（物理常数）：摩尔消光系数（物理常数）：摩尔消光系数（物理常数）：摩尔消光系数（物理常数）I I：出射光强度出射光强度出射光强度出射光强度 b b：光径：光径：光径：光径 I I0 0：入射光强度入射光强度入射光强度入射光强度 c c：吸光物质在溶液中的浓度：吸光物质在溶液中的浓度：吸光物质在溶液中的浓度：吸光物质在溶液中的浓度从上述公式中可以看出：吸光物质在溶液中的浓度（从上述公式中可以看出：吸光物质在溶液中的浓度（从上述公式中可以看出：吸光物质在溶液中的浓度（从上述公式中可以看出：吸光物质在溶液中的浓度（C C）与）与）与）与吸光度（吸光度（吸光度（吸光度（A A）成正比。溶液的浓度越大，所吸收的光的量）成正比。溶液的浓度越大，所吸收的光的量）成正比。溶液的浓度越大，所吸收的光的量）成正比。溶液的浓度越大，所吸收的光的量也越大。也越大。也越大。也越大。20仪器反应原理21一、原一、原 理理单单色色器器（Lambert-Beer）朗伯-比尔定律比比色色皿皿检检测测器器放放大大显显示示光源光源A=KbcA：吸光度 c：物质浓度 K：吸收系数 b：液层厚度 吸光度与该物质在特定波长下的溶液厚度与浓度变化成正比22h光源：常用的是卤素灯。最好的是贝克曼仪器的氙灯。h单色器：即滤光片。常用干涉滤光片。h比色皿：常用石英。要有良好的透光性和较强的耐腐蚀性。h光电检测器：将光能转化为电能。应具有灵敏度高，响应速度快，产生的电信号易于检测和放大，噪音低等特点。23常用的范围：常用的范围：常用的范围：常用的范围：200 200 800 nm800 nm紫外光区：紫外光区：紫外光区：紫外光区：200200400 nm400 nm可见光区：可见光区：可见光区：可见光区：400400760 nm760 nm生化检验中常用的吸收光谱范围24常用波长最常用的吸收波长有：最常用的吸收波长有：最常用的吸收波长有：最常用的吸收波长有：340340、380380、405405、410410、505505、546546、570570、600600、660660、700700、800nm 800nm 等。等。等。等。25常用波长使用使用使用使用340nm340nm波长的项目：波长的项目：波长的项目：波长的项目：HCYHCY、ALTALT、ASTAST、HBDHHBDH、LDHLDH、CKCK、CKMBCKMB、COCO2 2（CD127CD127）IgA/M、C3、C4使用使用使用使用380nm380nm波长的项目：波长的项目：波长的项目：波长的项目：COCO2 2（CD116CD116）使用使用使用使用405nm405nm波长的项目：波长的项目：波长的项目：波长的项目：ALPALP、GGTGGT、COCO2 2（GcellGcell）使用使用使用使用450nm450nm波长的项目：波长的项目：波长的项目：波长的项目：TBILTBIL、DBILDBIL（钒酸盐氧化法）（钒酸盐氧化法）（钒酸盐氧化法）（钒酸盐氧化法）使用使用使用使用505nm505nm波长的项目：波长的项目：波长的项目：波长的项目：TBILTBIL、DBILDBIL（重氮法）（重氮法）（重氮法）（重氮法）使用使用使用使用546nm546nm波长的项目：波长的项目：波长的项目：波长的项目：TGTG、CHOCHO、GLUGLU、CRECRE（酶）（酶）（酶）（酶）使用使用使用使用570nm570nm波长的项目：波长的项目：波长的项目：波长的项目：CysCCysC、BMGBMG、ASOASO、h-CRPh-CRP使用使用使用使用600nm600nm波长的项目：波长的项目：波长的项目：波长的项目：HDLHDL、LDLLDL使用使用使用使用700nm700nm波长的项目：波长的项目：波长的项目：波长的项目：HbA1cHbA1c、PGIPGI、PGIIPGII、IgGIgG26二、生化分析仪结构示意图二、生化分析仪结构示意图b：后分光（现在）a、前分光（过去）光栅检测器光源计算机反应池比色池反射镜反射镜狭缝比色池反应池光源计算机检测器光栅27h后分光的优点：可同时选用双波长进行测定，大大降低了躁声；通过双波长可以有效地抑制混浊、溶血、黄疸对实验测定的影响；双波长可有效地补偿由于电源变动造成的影响；使生化分析仪器多项目同时测定变为现实。28自动生化分析仪器的基本构成h样本/试剂系统：自动液面探针（增加速度和减少污染）；防堵塞功能；防碰撞保护功能h搅拌和冲洗系统：h恒温系统：h反应盘：h光路系统：全息光栅h操作系统：29三、分三、分 类类样品样品+试剂试剂1、流动式、流动式混混 合合计计 算算检检 测测流动比色池流动比色池排排 出出 特点：样品试剂在同一管道中，在流动中进行。2、分立式、分立式试剂试剂样品样品排排 出出检检 测测计计 算算独立反应比色杯独立反应比色杯 特点：样品、试剂分别进入某个项目的独立比色杯内，完成测试。30h离心式分析仪：将样本和试剂放在特制的圆盘上，圆盘装在离心机上作为转头。受离心力作用而相互混合。反应速度快。缺点同一时间只能做同一项目测定。h干式生化：价格昂贵，适合急诊。31试剂反应原理32比色法（仪器上一般设置为终点法）酶法；连续监测法（速率法）免疫比浊法33化学试剂盒常用的反应原理比色法比色法比色法比色法 由单纯的化学物质参与反应，呈色，在一定波长下比色。由单纯的化学物质参与反应，呈色，在一定波长下比色。由单纯的化学物质参与反应，呈色，在一定波长下比色。由单纯的化学物质参与反应，呈色，在一定波长下比色。例如总蛋白的双缩脲比色法、白蛋白的溴钾酚绿法。例如总蛋白的双缩脲比色法、白蛋白的溴钾酚绿法。例如总蛋白的双缩脲比色法、白蛋白的溴钾酚绿法。例如总蛋白的双缩脲比色法、白蛋白的溴钾酚绿法。酶法酶法酶法酶法 由特异性的酶来催化反应，在一定波长下比色。例如甘由特异性的酶来催化反应，在一定波长下比色。例如甘由特异性的酶来催化反应，在一定波长下比色。例如甘由特异性的酶来催化反应，在一定波长下比色。例如甘油三酯由甘油激酶和过氧化物酶来催化反应；尿素有脲油三酯由甘油激酶和过氧化物酶来催化反应；尿素有脲油三酯由甘油激酶和过氧化物酶来催化反应；尿素有脲油三酯由甘油激酶和过氧化物酶来催化反应；尿素有脲酶来催化反应进行。酶来催化反应进行。酶来催化反应进行。酶来催化反应进行。免疫比浊法免疫比浊法免疫比浊法免疫比浊法 抗体（抗体（抗体（抗体（AbAb）与可溶性抗原（）与可溶性抗原（）与可溶性抗原（）与可溶性抗原（AgAg）反应，形成一定结构）反应，形成一定结构）反应，形成一定结构）反应，形成一定结构的免疫复合物，成为悬浮于反应溶液中的微粒。这种在的免疫复合物，成为悬浮于反应溶液中的微粒。这种在的免疫复合物，成为悬浮于反应溶液中的微粒。这种在的免疫复合物，成为悬浮于反应溶液中的微粒。这种在沉淀反应中形成的微粒具有特殊的光学性质。沉淀反应中形成的微粒具有特殊的光学性质。沉淀反应中形成的微粒具有特殊的光学性质。沉淀反应中形成的微粒具有特殊的光学性质。34终点法被测物质（反应底物）在化学反应过程中完全被消耗或被测物质（反应底物）在化学反应过程中完全被消耗或被测物质（反应底物）在化学反应过程中完全被消耗或被测物质（反应底物）在化学反应过程中完全被消耗或转换，即反应达到平衡（终点），通过测定产物（反应转换，即反应达到平衡（终点），通过测定产物（反应转换，即反应达到平衡（终点），通过测定产物（反应转换，即反应达到平衡（终点），通过测定产物（反应生成物）的多少来定量测定被测底物的含量。生成物）的多少来定量测定被测底物的含量。生成物）的多少来定量测定被测底物的含量。生成物）的多少来定量测定被测底物的含量。反应曲线图如下：反应曲线图如下：反应曲线图如下：反应曲线图如下：351.终点法 举例：血糖（Glu）测定原理：葡萄糖+O2+H2O 葡萄糖酸+H2O2H2O2+4-AA+酚 醌亚胺+4H2O醌亚胺在480550nm有吸收峰PODGOD反应曲线单试剂t双试剂t样品加入后一段时间后吸光度达样品加入后一段时间后吸光度达到最大而且不再变化，说明反应到最大而且不再变化，说明反应完成，这样的项目为终点法。完成，这样的项目为终点法。362.速率法举例：谷丙转氨酶（ALT）测定原理：L-丙氨酸+-酮戊二酸 丙酮酸+L-谷氨酸丙酮酸+NADP+H L-乳酸+NAD+NADH在340nm波长下吸收峰下降ALTLDH反应进行时的某特定时间间隙内，进行一系列测定记录。在某时间间隔内有效测定其吸光度变化速率是分析浓度的函数。特别是在测定时间间隙内，记录下表现出反应中最佳线性部分的吸光度读数。37反应曲线单试剂At双试剂At双试剂At383.免疫比浊反应原理透射比浊法透射比浊法：是根据抗原、抗体结合形成的抗原抗体复合物能引起液体介质出现浊度的原理。当抗体过量存在时，与抗原形成复合物。颗粒增强免疫比浊法颗粒增强免疫比浊法：选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附或交联抗体后，透过光减少，这种减少与胶乳凝集成正比。反应曲线At39反应过程：抗体：病原体产生的蛋白质。抗原：机体体液免疫反应的产物，是一种特性的蛋白。复合物（不溶）抗原抗体平衡平衡复合物（溶解）抗原抗体抗体过量：抗体过量：复合物（溶解）抗体抗原抗原过量：抗原过量：前带现象前带现象：当抗原过量，抗体不足反应超限导致沉淀增加，浊度下降的现象40举例：载脂蛋白AI(APOAI)测定原理：血清中的APOA与试剂中的特异性抗人APOA抗体相结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生混浊，在340nm波长下检测混浊程度（透射比浊）。试剂组成：A A厂家厂家B B厂家厂家聚乙二醇4%（表面活性剂）表面活性剂Tris/HCl缓冲液15mmol/LTris缓冲液抗人APOA-抗体血清106mmol/L抗人APO-A抗体血清校正液 每批定值（多点定标）校正液 每批定值（多点定标）a)此试剂最关键的成份是抗血清的纯度亲和力及效价b)表面活性剂的作用是有助于APOA抗原位点暴露充分与抗体作用，并有缩短反应时间的作用。c)免疫比浊反应曲线特点近似抛物线，最低值偏高，最高值偏低。41谢 谢 诸 位！