蛋白质工程作业答案.doc

第三章 蛋白质工程 习题

1、 名词解释: 蛋白质工程: 是基于对蛋白质结构和功效关系认识, 进行分子设计, 经过基因工程路径定向地改造蛋白质或发明合乎人类需要新突变蛋白质理论及实践, 是基因工程基础上延伸, 是第二代基因工程。
蛋白质分子设计: 是为有目蛋白质工程改造提供设计方案, 即在知道了需要改造蛋白质性能及其对应结构基础以后, 经过理论方法, 提出蛋白质改造设计方案。
嵌合抗体: 用DNA重组技术将鼠源单抗可变区(V区)基因与人免疫球蛋白(Ig)恒定区(C区 )基因相连接,构建成嵌合基因,导入宿主细胞进行表示,制成嵌合抗体。现在中国外已制备了数十种嵌合抗体。
PDB:蛋白质结构数据库。
2、 请列表总结基因工程和蛋白质工程相同点、 不一样之处（从结果、 实质、 步骤等方面）及其联络。

基因工程

蛋白质工程

相同点

操作环境——生物体外; 操作对象——基因; 操作水平——分子

结果

天然存在蛋白

自然不存在蛋白

实质

基因重组

基因修饰或基因合成

步骤
中心法则

中心法则逆推

联络
蛋白质工程是在基因工程基础上延伸, 是第二代基因工程

3、 蛋白质工程基础目标、 基础路径是什么？
答: 基础目标: 对现有蛋白质进行改造,或制造一个新蛋白质, 以满足人类生产和生活需要。
基础路径: 基因修饰或基因合成: 借助计算机辅助设计、 基因定点诱变和重组DNA技术
4、 现在有哪些蛋白质工程分子改造常见方法？
答: ⒈基因定点突变技术（小改）: 即经过在DNA水平上进行碱基替换、 插入或缺失, 达成改变基因, 从而改变编码蛋白质结构技术, 包含核苷酸引物诱变, 盒式诱变, PCR诱变, 诱变。⒉基因剪切和融合（中改）: 原理: 将编码某蛋白部分基因移植到另种蛋白基因上, 经克隆、 表示, 产生新融合蛋白。可达成使蛋白易于表示、 纯化、 细胞定位等, 或使蛋白性质改变。⒊基因全合成（大改）: 合成DNA, 然后表示出对应蛋白。能够全部由人工控制, 便于设计和改造, 还适适用于同时实现多处突变。
5、 蛋白质工程中增加蛋白质稳定性基础路径有哪些？
答: 蛋白质结构与功效研究表明, 上述稳定蛋白质空间构象原因是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定, 人工改变或修饰这些氨基酸残基, 有可能增加蛋白质稳定性, 又不影响其生物学活性。
设计目标
处理措施
热稳定性

引入二硫桥
增加内氢键数目
改善内疏水堆积
增加表面盐桥
对氧化稳定性

把Cys转换为Ala或Ser
把Met转换为Gln、 Val、 Ile或Leu
把Trp转换为Phe或Tyr
对重金属稳定性

把Cys转换为Ala或Ser
把Met转换为Gln、 Val、 Ile或Leu
替换表面羧基
pH稳定性

替换表面荷电基团
His、 Cys以及Tyr置换
内离子对置换
提升酶学性质
专一性改变
增加逆转数(turnover number)
改变酸碱度

6、 请简述PCR介导定点突变技术原理及优缺点。
答: 4种引物3次PCR。优点: 操作简单, 突变成功率可达100%。缺点: ①后续工作较复杂, PCR扩增通常需要连接到载体分子上, 然后才能对突变基因进行转录, 翻译等方面研究。②不管是用一般TaqDNA聚合酶还是高保真Pfu酶, PCR方法产生DNA片段都要经过核苷酸序列测定, 方可确证有没有其她突变发生。
7、 天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体, 延缓胰岛素从注射部位进入血液, 从而延缓了其降血糖作用, 也增加了抗原性, 其结构以下。将胰岛素B9残基上极性Ser置换为带电荷Asp, 同时把B27极性Thr置换为带负电荷Glu, 由此可制成速效胰岛素。请叙述其原理。
答: 已知二体形成过程中, 两个分子结合面上SerB9与β链α螺旋上Glu B13侧链相靠近, 两个分子间Glu B13相靠近, 而且侧链上带有相同电荷, 它们本身就有互斥作用。假如将临近Ser B9置换为Asp, 可在二体间形成连续4个带负电侧链, 在六体中这种互斥接触反复三次, 应该有利于降低胰岛素分子缔合作用。经过这么改造, 双突变Ser B9 Asp/Thr B27 Glu有效地使二体在毫摩尔浓度下解聚为单体, 它进入血液吸收率也比天然胰岛素提升了三倍。核磁共振谱研究表明它也保持了与天然蛋白相同只要结构特征。
8、 枯草杆菌蛋白酶BNP不含二硫键, 用蛋白质工程引入二硫键时, 会有怎样效果？
答: 蛋白质结构愈加稳定, 热稳定性增强, 二硫键形成迫使同一或不一样肽链不一样区域氨基酸残基向一起靠拢聚合, 由此肽链快速折叠并形成稳定空间拓扑结构, 该区域氨基酸残基数量是高度密集; 同时疏水氨基酸残基围绕二硫键, 可形成局部疏水中心, 拒绝水分子进入肽内部破坏氢键, 利于形成稳定高级结构区域。
9、 举例说明蛋白质工程在医药等领域应用结果。
答: 1、 抗体工程: ①临床用鼠源单抗, 面临免疫排斥问题, 引发失效和过敏, 所以兴起了抗体工程。有嵌合抗体、 重构抗体、 单链抗原结合区、 单功效域抗体及全套抗体研究,其关键目是使鼠源性抗体“人源化”。
②嵌合抗体——用DNA重组技术将鼠源单抗可变区(V区)基因与人免疫球蛋白(Ig)恒定区(C区 )基因相连接,构建成嵌合基因,导入宿主细胞进行表示,制成嵌合抗体。现在中国外已制备了数十种嵌合抗体。
③该抗体 “人源化”使其免疫原性大为降低。在早期临床试验中,人源化嵌合抗体能够处理部分问题,且半衰期能够延长很多倍。但尚不能全部处理免疫原性问题, 有嵌合抗体仍引发免疫反应。
④重构抗体——是将动物抗体中高可变区,又称补体决定区与人抗体对应区域交换而重新构建抗体补体决定区,以深入“人源化”、 降低单抗免疫原性。现已构建成功数种重构抗体, 它们抗原结合能力得以保持。
2、 改良枯草杆菌蛋白酶性质: ①218位Asn, 变成Ser, 用65℃失活半衰期衡量, 从59分钟增到223分钟, 酶稳定性显著增加。
②1985年Wells证实若用其她氨基酸替换Met222, 能够提升枯草杆菌蛋白酶氧化稳定性而又保持高催化活性。
③枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂添加剂, 但底物作用范围过窄（针对Phe羧基所形成肽键）, 用Lys替换位于活性中心166位Gly, 使其底物作用范围拓宽。
3、 改良胰岛素: 天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体, 延缓胰岛素从注射部位进入血液, 从而延缓了其降血糖作用, 也增加了抗原性, 这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基, 则可降低其聚合作用, 使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已经过临床试验。
4、 改良生长激素:生长素有时会结合催乳激素受体, 引发副作用, 18位、 21位氨基酸改造, 可能有望降低这种副作用。
5、 改良治癌酶:改良疱疹病毒胸腺嘧啶激酶有杀死癌细胞功效, 有些人筛选到6个AA替换后（活性部位周围）, 催化能力大大提升。
6、 改良T4溶菌酶: 将T4溶菌酶第3位异亮氨酸变成半胱氨酸, 后者与第97位半胱氨酸形成二硫键, 从而稳定了两个结构域所形成活性中心, 使酶在高温下稳定性大大提升。假如将该酶第51位苏氨酸换成脯氨酸, 可使酶活性提升25倍。