几种常见的基因测序技术的优缺点及应用.doc

多个常见基因测序技术优缺点及应用
公布时间:-07-19 起源:毕业论文网
　　伴随人类基因组计划完成, 人类对本身遗传信息了解和掌握有了前所未有进步。与此同时, 分子水平基因检测技术平台不停发展和完善, 使得基因检测技术得到了迅猛发展, 基因检测效率不停提升。从最初第一代以 Sanger 测序为代表直接检测技术和以连锁分析为代表间接测序技术, 到 年, 以 Illumina 企业 Solexa技术和 ABI 企业 SOLiD 技术为标志新一代测 序 (next-generation sequencing, NGS) 相 继 出现, 测序效率显著提升, 时间显著缩短, 费用显著降低, 基因检测手段有了革命性改变。其技术正向着大规模、 工业化方向发展, 极大地提升了基因检测检出率, 并扩展了疾病在基因水平研究范围。 年 3 月, 约翰霍普金斯大学研究人员在《Science》杂志上发表了经过 NGS外显子测序技术, 发觉了一个新遗传性胰腺癌致病基因 PALB2, 标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因判定研究。同年, 《Nature》发表了采取 NGS 技术发觉罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。以后, 经过 NGS 技术, 与遗传相关致病基因不停被发觉, NGS 技术已成为里程碑式进步。 年, 《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。

　　近两年, 基因检测成为临床诊疗和科学研究热点, 得到了突飞猛进和日新月异发展, 越来越多临床和科研结果不停涌现出来。同时, 基因检测已经从单一遗传疾病专业范围扩展到复杂疾病和个体化应用愈加宽广领域, 其临床检测范围包含高危疾病新生儿筛查、 遗传疾病诊疗和基因携带检测以及基因药品检测用于指导个体化用药剂量、 选择和药品反应等很多方面研究。现在, 基因检测在临床诊疗和医学研究应用正越来越受到医生普遍重视和引发研究人员极大爱好。

　　本文介绍了多个 DNA 水平基因检测常见方法, 比较其优缺点和在临床诊疗和科学研究中应用, 对指导硕士和临床医生课外学习, 推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。

　　1、 第一代测序

　　1.1 Sanger 测序　采取是直接测序法。1977年, Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法, 这一技术随即成为最为常见基因测序技术。 年, Allan Maxam 和 Walter Gibert 发 明了 Sanger 测序法, 并在以后 10 年里成为基因检测金标准。其基础原理即双脱氧核苷三磷酸 (dideoxyribonucleoside triphosphate, ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需 3'-OH, 所以每当 DNA 链加入分子 ddNTP, 延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立反应组成, 将模板、 引物和 4 种含有不一样放射性同位素标识核苷酸 ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一片段, 大量起始点相同、 终止点不一样 DNA 片段存在于反应体系中, 含有单个碱基差异 DNA 序列能够被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来, 得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取 DNA 双链碱基序列。

　　人类基因组测序正是基于该技术完成。Sanger 测序这种直接测序方法含有高度正确性和简单、 快捷等特点。现在, 仍然对于部分临床上小样本遗传疾病基因判定含有很高实用价值。比如, 临床上采取 Sanger 直接测序 FGFR 2 基因证实单基因 Apert 综合征和直接测序 TCOF1 基因能够检出多达 90% 与 Treacher Collins 综合征相关突变。值得注意是, Sanger 测序是针对已知致病基因突变位点设计引物, 进行 PCR 直接扩增测序。单个突变点扩增包含该位点在内外显子片段即可, 无须将该点所在基因全部外显子都扩增。

　　所以, 应明确定位要扩增位点所在基因外显子和该点具体位置, 设计包含该点在内上下游 150 ~ 200 bp 外显子片段引物。另外, 尽管有NGS 出现, 但 Sanger 测序对于有致病基因位点明确而且数量有限单基因遗传疾病致病基因检测是非常经济和高效。到现在为止, Sanger 测序仍然是作为基因检测金标准, 也是 NGS 基因检测后进行家系内和正常对照组验证关键手段。

　　值得注意是, Sanger 测序目是寻求与疾病相关特定基因突变。对于没有明确候选基因或候选基因数量较多大样本病例筛查是难以完成, 这类测序研究还要依靠含有高通量测序能力 NGS。即使 Sanger 测序含有高度分析正确性, 但其正确性还取决于测序仪器以及测序条件设定。另外, Sanger 测序不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变类型, 所以对于部分与此相关遗传性疾病还不能做出基因学诊疗。

　　1.2 连锁分析　采取是间接测序法。在 NGS 出现之前, 国际通用疾病基因定位克隆策略是建立在大规模全基因扫描和连锁分析基础上位置候选基因克隆。人类染色体成对出现, 一条来自父亲, 一条来自母亲, 每一对染色体在一样位置上拥有相同基因, 不过其序列并不完全相同, 被称为父系和母系等位基因。遗传标识是指在人群中表现出多态现象 DNA 序列, 可追踪染色体、 染色体某一节段或某个基因座在家系中传输任何一个遗传特征。它存在于每一个人, 但大小和序列有差异, 含有可遗传性和可识别性。现在采取第二代遗传标识, 即反复序列多态性, 尤其是短串联反复序列, 又称微卫星标识。连锁分析是以连锁这种遗传现象为基础, 研究致病基因与遗传性标识之间关系方法。假如控制某一表型性状基因周围存在遗传标识, 那么利用某个遗传标识与某个确定位基因之间是否存在连锁关系, 以及连锁紧密程度就能将该基因定位到染色体某一位置上。1986 年 Morton 等提出优势对数记分法 (log odds score method, LOD), 关键检测两基因以某一重组率连锁时似然性。LOD 值为正, 支持连锁 ;LOD 值为负, 则否定连锁。经过计算家系中微卫星标识与致病位点之间 LOD 值, 能够初步估算二者间遗传距离及连锁程度, 从而确定该基因在染色体上粗略位置。然后利用该区域染色体基因图谱, 分析定位区域内全部基因功效与表示, 选择适宜候选基因进行突变检测, 最终将致病基因定位或克隆。

　　然而, 采取连锁分析进行基因检测存在很大不足。不仅所需遗传样本量较大, 通常要求提供三代及以上遗传家系患者血样, 而且数据量大、 处理复杂、 产出速度较慢、 定位不够正确 ( 通常只能定位在染色体某一区间 ), 这就使得研究工作繁重和定位基因时间周期尤其长。现在, 连锁分析采取单核苷酸多肽性和短串联反复序列还在使用, 但经典间接测序方法, 如单链构象多肽性、 变性梯度凝胶电泳和异源双链分析在美国已被淘汰, 而在发展中国家作为研究手段还在有限使用。

　　2、 新一代测序 (NGS)

　　主 要 包 括 全 基 因 组 重 测 序 (whole-genomesequencing, WGS)、 全外显子组测序 (whole-exomesequencing, WES) 和目标区域测序 (Targeted regionssequencing, TRS), 它们同属于新一代测序技术。总体而言, NGS 技术含有通量大、 时间短、 正确度高和信息量丰富等优点, 使得遗传学者能够在短时间内对感爱好基因进行正确定位。但这些不一样测序技术在测序范围、 数据分析量以及测序费用和时间等方面又有很大差异, 假如选择适合方法, 对于临床诊疗和科学研究将起到事半功倍作用。

　　2.1 目标区域测序　现在常见是基因芯片技术。其测序原理是基于 DNA 杂交原理, 利用目标基因组区域定制探针与基因组 DNA 进行芯片杂交或溶液杂交, 将目标基因区域 DNA 富集, 再经过NGS 技术进行测序。其测序过程是经过把数以万计 cDNA 或寡聚核苷酸置于芯片上制成列阵, 将芯片上固定好已知序列核苷酸探针与溶液中含有荧光标识对应核酸序列进行互补配对, 依据测序仪所显示强荧光位置和强度, 获取每组点阵列信息, 再利用生物信息学算法确定目靶核苷酸序列组成。测序所选定目标区域能够是连续 DNA 序列, 也能够是分布在同一个染色体不一样区域或不一样染色体上片段。目标区域测序技术, 对于以往经过连锁分析将基因突变锁定在染色体某一片段区域内, 但无法找出突变是一个非常好深入检测手段。 年, Nicholas等使用基因分型芯片联合连锁分析技术, 成功发觉头小畸形新基因 WDR62, 文章发表在《NatGenet》杂志。类似研究在家族性胰腺癌中确定 8 个候选变异位点和在家族性渗出性玻璃体视网膜病变发觉易感基因 TSPAN12。

　　基因芯片测序技术能够将经过连锁分析锁定了目标范围或经过全基因组筛选特定基因或区域进行更深一层研究, 是处理连锁分析无法发觉致病基因有效手段。基因芯片技术对于已知基因突变筛查含有显著优势, 能够快速、 全方面地检测出目标基因突变。同时, 因为目标区域受到了限制, 测序范围大幅度降低, 测序时间和费用对应降低。但基因芯片检测所需要 DNA 量要大, 因为已提取 DNA 存在降解风险, 用于基因芯片研究血标本最好是冰冻全血, 这么能够使用于检测 DNA 量有充足确保。

　　2.2 全外显子组测序 (WES)　外显子组是单个个体基因组 DNA 上全部蛋白质编码序列总合。人类外显子组序列约占人类全部基因组序列 1%, 但大约包含 85% 致病突变。WES 是利用序列捕捉技术将全外显子区域 DNA 捕捉并富集后进行高通量测序基因分析方法。采取技术平台关键是罗氏企业 SeqCap EZ 全外显子捕捉系统, Illumina 企业 Solexa 技术和 Agilent 企业 SureSelect 外显子靶向序列富集系统。其捕捉目标区在 34 ~ 62 M 之间, 不仅包含编码区同时也加入了部分非编码区。NGS 测序过程关键包含DNA 测序文库制备、 锚定桥接、 PCR 扩增、 单碱基延伸测序和数据分析。研究者依据测序仪捕捉到在测序过程中掺入有不一样荧光标识碱基片段, 经计算机将荧光信号转化成不一样颜色测序峰图和碱基序列。基因测序结果与NCBISNP数据库、 千人基因组数据库等国际权威数据库比对, 最终确定是否为突变基因。

自NGS 技术问世以来, 利用 WES 在临床疾病致病基因判定研究中取得前所未有结果。这些结果不仅集中在单基因遗传疾病, 还在多基因影响复杂疾病中取得大量相关基因发觉。在单基因遗传性疾病中, 如视网膜色素变性、 终端骨发育不良等发觉新基因或已知基因新突变。在部分罕见疾病中, 如 Kabuki 综合征、 家族性混合型低脂血症和脊髓小脑共济失调症等疾病中发觉新致病基因。同时, 在小细胞肺癌、 慢性淋巴细胞性白血病等肿瘤研究和诸如肥胖症、 脑皮质发育不良等复杂疾病研究中也取得丰硕结果。
WES 技术在筛查范围和检出率等方面较其她测序技术含有显著优势。比如, 对于采取 Sanger测序和基因芯片测序不能筛查出基因样本, 能够采取 WES 来深入基因筛查判定。应用 WES技术能够取得较传统 Sanger 等方法对编码区测序更深覆盖度和更正确数据。因为信息量大幅度增加, WES 能够取得更多个体编码区信息, 所以成为检测致病基因和易感基因位点有效手段。与连锁分析定位方法比较, WES 对家系要求并不十分严格, 在单基因遗传病同一家系中有 2 ~3 个患者和 1 个正常人即可进行致病基因判定研究, 而不需要连续三代遗传家系。因为不需要严格三代以上遗传家系, WES 使以前不能进行研究家系成为可能。不仅对于单基因遗传病是一个很好研究手段, 对于很多常见病, 如肿瘤、 糖尿病等疾病也可进行大规模比较研究。

　　2.3 全基因组重测序 (WGS)　WGS 是对已知基因组序列物种进行不一样个体全基因组测序, 经过数据分析后对序列进行拼接、 组装并取得基因组图谱, 或是对不一样组织进行测序并分析体细胞突变一个研究方法。尽管 WES 能够快速全方面地找出个体基因组上全部突变, 从而找到个体间差异, 但对于外显子以外区域则不能有效地进行基因检测。对于此种情况, 现在还要借助WGS 进行全基因组检测。但因为人类基因组过于庞大, 一次单端全基因组测序极难达成所需要测序深度。所以, 需要反复测序或双端测序, 由此带来测序成本大幅度提升和因为不能达成足够测序深度所造成结果正确性降低。而对于临床疾病诊疗和一般科研工作, 其高昂检测费用也是难以承受。尽管如此, 对于部分临床研究和 WES 不能处理科研课题还需要借助 WGS进行愈加全方面基因检测。

　　3、 展望

　　NGS 出现为新兴基因组技术增添了无限活力和想象空间。尤其是基因芯片问世和已在临床上应用于大样本疾病筛查和基因诊疗中所展现出活力, 以及其商业化发展模式都令人鼓舞。在眼科是单基因病最常见学科, 利用芯片技术进行 Laber 病筛查已使很多病因不清楚视神经萎缩得到明确诊疗。而原发性开角型青光眼是眼科最具隐蔽性和危险性致盲性眼病, 其致病基因或突变判定研究对疾病筛查将有着非常关键临床价值和巨大商业价值。在新生儿糖尿病筛查中采取基因芯片技术能够愈加紧速、 全方面经济, 避免第一代测序过于繁琐和漏检。

　　基因芯片技术在产前诊疗中愈加含有发展前景。只要对孕妇进行 DNA 血液检验即可进行遗传疾病筛查, 避免以往经过羊膜穿刺抽取羊水进行有创检验不足和危险性。现在, 基因检测技术水平提升和检测费用不停降低, 发展大规模个体化基因检测在很快未来成为可能。同时, 药品易感性基因和疾病发生易感基因检测深入开展, 个体化医疗将在基因检测基础上得以实现。有理由相信, 伴随大家生活水平不停提升和健康意识不停增强, 基因检测在未来医学发展中应用前景将十分可观。