生物技术资料.doc

1生物技术: 生物技术有时也称生物工程, 是指大家以现代生命科学为基础, 结合其她基础学科科学原理, 采取优异工程技术手段, 根据预先设计改造生命体或加工生物原料, 为人类生产出所需产品或达成某种目。
2基因工程: （DNA体外重组技术）应用人工方法把生物遗传物质（通常是DNA）分离出来, 在体外进行切割、 拼接和重组, 然后将重组DNA导入某种宿主细胞或个体, 从而改变它们遗传品性, 有时还使新遗传信息在新宿主细胞或个体中大量表示已取得基因产物。
3细胞工程: 是指以细胞为基础单位, 在体外进行培养、 繁殖, 或人为地使细胞一些生物学特征按大家意愿发生改变, 从而达成改良生物品种或发明新品种; 或加速繁育动植物个体; 或取得一些有用物质过程。（包含动植物细胞体外培养技术、 细胞融合技术、 细胞器移植技术、 克隆技术和干细胞技术等）
4发酵工程: 利用微生物生长速度快、 生长条件简单以及代谢过程特殊等特点, 在适合条件下, 经过现代化工程技术手段, 由微生物某种特定功效生产出人类所需产品。
5酶工程: （包含酶固定化技术、 酶反应器设计及应用、 酶制备）是利用酶、 细胞器或细胞所含有特异催化功效, 对酶进行修饰改造, 并借助生物反应器来生产人类所需产品一项技术。
6蛋白质工程: 是指在基因工程基础上, 结合蛋白质结晶学、 计算机辅助设计和蛋白质化学等学科基础知识, 经过对基因人工定向改造等手段, 对蛋白质进行修饰、 改造和拼接以生产能满足人类需要新型蛋白质技术。
7简明说明生物技术发展史以及现代生物技术与传统生物技术关系。发展史: 传统生物技术从史前时代起就一直为大家所开发利用, 首先是发酵技术应用, 证实了发酵是由微生物引发, 并建立了微生物纯种培养技术。在发酵工程带动下, 发酵业和酶制剂业大量涌现。因为遗传学建立及其应用, 细胞学理论被利用于细胞工程。但这些发面发展不含有高新技术要素, 被称为传统生物技术。现代生物技术是以20世纪60年代DNA重组技术建立为标志。它说明了DNA是遗传信息携带者。揭示了DNA编码遗传信息传输给蛋白质秘密。实现了DNA体外重组技术。它向大家提供了一个全新技术手段, 使大家能够根据意愿取得所需产品。形成了含有划时代意义和战略价值现代生物技术。关系: 现代生物技术是从传统生物技术中发展而来。在传统细胞工程基础上, 利用高新技术实现了基因改造——现代生物技术。
8 生物技术对经济社会发展影响: （一）改善农业生产, 处理粮食短缺1, 提升农作物产量及品质（1）培育抗逆作物优良品系（2）植物种苗工厂化生产（3）提升粮食品质（4）生物固氮（5）生物农药, 生产绿色产品2, 发展畜牧业生产（1）动物大量快速无性繁殖（2）培育动物油量品系（二）提升生命质量, 延长人类寿命1, 开发制造奇特而又珍贵新型药品2, 疾病预防和诊疗3, 基因诊疗4, 人类基因组计划（HGP）（三）处理能源危机, 治理环境污染（四）制造工业原料, 生产珍贵金属（五）生物技术安全及其对伦理道德法律影响
9基因工程基础步骤？基因工程在现实生活中应用价值？（1）从供体生物基因组中, 分离取得带有目基因DNA片段（2）在体外, 将目基因插入能自我复制载体中（3）将重组分子导入到受体细胞中并进行繁殖（4）选择得到含有充足DNA分子细胞克隆, 并进行大量繁殖, 从而使目基因得到扩增（5）深入对取得目基因进行研究分析, 并设法使之实现功效蛋白表示。基因工程应用: 基因工程药品、 基因疫苗、 转基因植物、 转基因动物以及在酶制剂工业、 食品工业、 化学与能源工业及环境保护等方面。
10限制性核酸内切酶, 怎样命名。定义: 是一个能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列, 并能正确特意切割双链DNA分子核酸内切酶。命名: （1）寄主菌属名第一个字母（大写）和种名前两个字母（小写）斜体略名, 表示酶起源菌种名称, 如大肠杆菌Eco（2）用一个大写字母表示菌株类型（3）假如一个特殊寄主菌株中, 含有多个不一样限制修饰体系, 则以罗马数字表示该菌株中发觉某种酶前后次序（4）全部限制酶除了以上名称外, 前面还冠以系统名称, 限制性核实内切酶系统名称为R, 甲基化为M。
11Ⅱ型限制性核酸内切酶基础特征: 识别位点特异性, 每种酶都有其特定DNA识别位点; 识别序列对称性, 靶序列通常含有双重旋转对称结构, 呈回交结构; 切割位点规范性, 双链DNA被酶切后分布在两条链上切割位点旋转对称。仅需mg+辅助发生作用。
12粘性末端: 因酶切位点在两条DNA单链上不一样酶切后形成含有互补碱基单链末端结构, 酶切产生2个粘性末端很同意经过互补碱基配对而重新连接起来。平末端: 因酶切位点在两条DNA单链上相同, 酶切后形成平齐末端结构, 这种末端不易重新连接起来。同裂酶: 能识别和切割一样核苷酸靶序列不一样内切酶。同尾酶: 识别靶序列不一样, 但能产生相同粘性末端一类限制性核实内切酶。
13 DNA连接酶作用特点？特点: (1)连接两条链必需分别含有3端自由羟基和5端磷酸基团, 而且只有这两个基因相互相邻才能进行连接反应(2)在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一个耗能过程, 所以连接反应必需有能量分子参与, 通常有两种能量分子, ATP和NAD+。用于连接粘性末端和平末端。在平末端DNA片段末端加尾连接法: （1）末端核苷酸转移酶能够在平端加部分碱基（2）平末端DNA加接头连接法
14大肠杆菌DNA聚合酶不一样酶活力特征？利用价值？活性特点及应用: （1）5‘—3’DNA聚合酶活性, 以双链DNA 为模板, 催化单个核苷酸结合到引物3末端并不停延伸。用于DNA连接后大缺口填充（2）5‘—3’外切酶活性, 将双链DNA中游离5末端逐一切去。用于制备高比活度DNA探针3）3‘—5’外切酶活性, 将游离双链或单链DNA3端降解。用于DNA序列分析。
15 klenow片段和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有何异同？ klenow片段是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶经过枯草杆菌蛋白酶处理后产生大片段酶分子。仍有5‘—3’聚合酶活性和3‘—5‘核酸外切酶活性, 但失去了5‘—3’外切酶活性。
16 为何逆转录酶是一个特殊DNA聚合酶, 关键用途？ 逆转录酶是一个能够有效地将mRNA转录为DNA酶, 其产物称为cDNA, 实际上也是一个RNA依靠DNA聚合酶。（1）有5‘—3’DNA聚合酶活性, 能以RNA或DNA为模板合成DNA分子, 后者合成很慢（2）RNA酶活性, 能从5‘或3‘方向特异性降解DNA: RNA杂交分子中RNA链。用途: 将mRNA转录成cDNA, 以制备基因片段。真核生物含有外显子和内含子, 用cDNA法能够去掉内含子, 用于用于制备基因片段, 而原核生物可直接利用其基因片段。
17 举例说明在基因工程中修饰性工具酶用途？A、 末端脱氧核苷酸转移酶: 末端脱氧核苷酸转移酶是一类不依靠于DNA模板DNA聚合酶; 该类酶能够在没有模板链存在情况下, 将核苷酸连接到DNA3‘ 羟基端, 尤其是对平末端双链DNA末端加尾十分有效; 最常见用途是在酶切产生平末端, 方便产生粘性末端。B、 S1核酸酶: 在cDNA合成过程中, 切开其发夹结构; 载体构建过程中, 切去DNA片段单链尾巴。C、 碱性磷酸化酶: 在用P标识DNA5‘端前, 去掉5’端P, 预防载体本身环化, 形成二聚体; 用于DNA重组技术中, 去掉DNA5‘端P。
18 内切酶和连接酶作用机理。内切酶: 类型Ⅰ、 Ⅲ: 都有甲基化, 依靠于ATP, 限制性内切酶活性。Ⅲ型酶在识别部位进行切割很轻易从底物上解离。Ⅰ型酶是切割, 识别部位不等于切割部位, 能长生不一样末端。类型Ⅱ特点: 识别部位不等于切割部位。（1）在DNA双链特异性识别部位进行切割产生特定DNA序列。（2）两个单链部位在DNA分子上不是相互相对。（3）断裂结果形成DNA片段往往含有互补单链延伸末端。连接酶: 能够催化双链DNA片段紧靠在一起3‘-OH末端与5‘-P末端形成磷酸二脂键, 使俩末端相连。连接方法（1）用DNA连接酶连接含有互补粘性末端片段（2）用T4DNA连接酶将末平端片段连接（3）平末端片段片段加上衔接头或人工合成连杆使之成为粘性末端后用DNA连接酶连接
19 PCR: 一个模拟DNA体内复制过程体外DNA复制过程, 在一个离心管缓冲液体系中, 加入DNA模板, d-NTPs、 引物和DNA聚合酶, 经过变性、 退火、 延伸三个温度不停循环, 使目标DNA得到快速大量复制, 需要两条合成寡核苷酸片断和耐热DNA聚合酶。
开启子: 在基因序列中, 标志着转录起始能够被RNA聚合酶识别位点（DNA区段）, 通常位于基因上游。
终止子: 位于基因编码序列之外（通常在下游）一段标志着转录停止RNA聚合酶识别位点。
Ti质粒: 根癌农杆菌核外一个环状双链DNA分子, 约200kb, Ti质粒结构上可分为毒性区、 T-DNA区、 结合转移区、 复制起始区。
SD序列: 位于起始密码子上游一段保守序列, 为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需, 通常长约3-9bp, 位于起始密码子上游3-11碱基位置, 它与16S核糖体RNA3端互补, 控制翻译起始。
反义链: 下链或模板链, 在基因DNA双链中, 转录时作为mRNA合成模板那条单链。
基因文库: 是指聚集了某一生物基因组DNA全部序列重组体DNA群体（转化子群）。具体来说, 构建基因文库时, 首先将代表某一生物类型全部DNA片段分别插入到特定载体上, 然后将重组载体导入到宿主细胞并取得大量含有重组载体克隆（通常为单菌落或噬菌斑）。
DNA探针: 经放射性或非放射性物质标识已知特定DNA序列。
载体构建: 用限制性酶切取目基因, 再用同一个限制酶切开质粒, 用连接酶把目基因和质粒连接起来过程。
转化: 将一般质粒分子导入受体细胞过程。感受态细胞: 经过处理后处于轻易接收外源DNA状态细胞。
多克隆位点: 克隆载体中一段用于插入外源DNA片段特定区域, 由一系列紧密相连限制性内切酶位点组成, 而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一。
选择标识基因: 在基因工程中一类用于选择转化细胞（菌）抗性基因, 通常是部分抗生素抗性基因, 比如对氨苄青霉素、 四环素氯霉素、 卡那霉素以及潮霉素等含有抗性基因, 这么, 经过在培养基中加入特定抗生素就能够选择得到转化细胞（菌）。
Cos位点: λDNA为线状双链DNA分子, 在分子两端各有12个碱基单链互补粘性末端, 当其注入到寄主细胞中后, 能够快速经过粘性末端形成双链环状DNA分子, 这种经过粘性末端互补结合成双链区段称为cos位点
60 1973年DNA体外重组试验成功。所以, 1973年是基因工程诞生元年
20 上世纪40到70年代初分子生物学领域理论上和技术上有哪些重大突破对于基因工程诞生起到了决定性作用？理论上三大发觉和技术上三大发明为基因工程诞生起到了决定性作用: （1）DNA是遗传物质被证实（2）DNA双螺旋模型被提出（3）“中心法则”提出 技术上三大发明: a、 核酸限制性内切酶发觉和应用b、 DNA连接酶发觉和应用c、 载体发觉及其应用。
21 酶单位定义？影响酶活性原因？一个酶单位: 在理想反应条件下（适宜缓冲液和反应温度, 通常为37℃）, 在50微升反应体系中, 1h完全降解1微克DNA所需要酶量。影响酶活性原因: DNA纯度和甲基化程度; 甘油含量; 反应体系中离子强度; 反应体系中PH值; 反应温度条件。
22 基因克隆载体: 能够承载外源基因, 并将其带入受体细胞得以稳定维持DNA分子。含有条件: 含有针对受体细胞亲缘性和亲和性; 含有与特定受体细胞相适应整合位点, 复制位点; 含有较高外源DNA装载能力; 含有多个单一限制性内切酶识别位点; 含有适合筛选标识。
23 Ti质粒: 根癌农杆菌核外一个环状双链DNA分子, 约200kb, Ti质粒结构上可分为毒性区、 T-DNA区、 结合转移区、 复制起始区。
24 分离目基因路径: 酶切直接分离法, PCR扩增法, 化学合成法, 构建基因组文库, cDNA文库分离法
25 转化: 经过物理化学等方法使外源裸露DNA进入受体细胞, 并在受体细胞内维持稳定和表示过程。转染: 假如以病毒为克隆载体, 则此过程成为转染。
26 克隆子: 摄取外源DNA分子并在其中稳定维持受体细胞。转化子: 采取转化方法取得克隆子。重组子: 真正得到DNA克隆子。
27 细胞培养技术: 是指动物、 植物或微生物细胞在体外无菌条件下保留和生长。细胞融合技术: 是指采取自然或人工方法使两个或两个以上不一样细胞或原生质体融合为一个细胞, 不经过有性过程而达成杂种细胞方法。细胞重组技术: 是指从活细胞中分离出细胞器或其组分, 然后将不一样起源细胞器在体外条件下进行重组, 使其重新装配成含有生物活性细胞或细胞器一个试验技术。
28融合技术过程: 制备原生质体; 诱导细胞融合; 筛选杂合细胞
29 原生质体制备: 取材与除菌; 酶解; 分离; 洗涤; 判定。 融合: 物理法, 化学法。
30 人工种子？制备? 人工种子结构: 人工种皮、 人工胚乳、 胚状体。人工种皮: 包裹在人工种皮最外层胶质化合物薄膜。人工胚乳: 指人工配置能够确保胚状体正常发育营养物质。胚状体: 是指由组织培养产生含有胚芽, 胚根和类似天然种子胚结构。人工种子制备: 1）胚状体诱导 2）包裹制种 3）发芽试验
31巴斯德: 研究了酒精发酵生理意义, 认为发酵是酵母在无氧环境下呼吸过程。
30 含有生产价值发酵类型: 微生物菌体发酵; 微生物酶发酵; 微生物代谢产物发酵; 微生物转化发酵; 生物工程细胞发酵。
32 液体深层发酵优点: 液体发酵培养是微生物生长最适环境; 液体中菌体营养物, 产物易于扩散使发酵可在均质中进行, 便于扩大生产规模, 便于控制; 液体便于输送, 便于机械化生产; 厂房面积小, 生产效率高, 易于自动化控制; 产物易于提取, 精制。
33 分类: 分批发酵, 连续发酵, 分批补料发酵（半连续发酵）。分批发酵特点: 环境非常稳态, 微生物生长四个时期显著, 发酵过程中, 营养物质不停降低, 微生物不停增值; 但易染菌, 微生物易变异, 对产品类型适应性不广, 对设备及附件要求高。 连续发酵特点: 相对稳定, 降低灭菌次数, 易于过程优化, 添加新鲜培养基, 克服养分不足所造成发酵过程提早结束。 补料分批发酵特点: 灭菌要求低, 菌种变异退化少, 适用范围广。
34 发酵工艺控制: 发酵过程中, 需要对相关工艺参数进行定时取样进行测量。直接参数: 温度, 压力, 搅拌功率, 转速, 泡沫, 发酵液黏度, 浊度, PH, 离子浓度, 溶解氧和基质浓度。间接参数: 细胞生长速率, 产物合成速率, 呼吸熵。首先, 对于温度, 影响多种酶反应速率, 改变菌体代谢产物合成方向, 影响微生物代谢调控机制, 另外, 对于发酵液黏度, 基质和氧在发酵液中溶解度和传输速率, 一些物质分解和吸收速率等有影响, 进而影响发酵动力学特征, 和产物生物合成。其次, 对于PH, 影响酶活性, 会阻碍菌体新陈代谢, 影响微生物细胞膜所带电荷状态, 改变其通透性, 影响微生物对营养物质吸收和代谢物质排放, 影响培养基中一些组分和中间代谢产物解离, 从未影响微生物对这些产物利用, PH不一样会引发菌体代谢过程不一样, 使代谢产物质量和百分比发生改变, 还会影响一些霉菌形态。第三, 溶解氧浓度。能够经过调整搅拌转速或通气速率来控制。
345 发酵过程混入杂菌: 将人类所需次级代谢产物分解, 产量降低, 影响经济效益, 混入杂菌与菌种形成竞争关系。
36 固液发酵区分: 固体发酵设备简单, 操作轻易, 并可因陋就简, 因地制宜利用部分起源丰富工农业副产品, 但这种方法劳动强度大, 不便于机械化操作, 微生物品种少, 生长慢, 产品有限。
液体深层发酵优点见上。
37 发酵工程发展经历了那多个时期？1）天然发酵阶段2）发酵技术第一个转折时期——纯培养技术3）第二个转折时期——通气搅拌技术建立, 抗生素发酵开始。工业化, 现代发酵工业开端。4）第三转折时期——代谢控制发酵技术, 谷氨酸发酵菌产生。5）第四个转折时期——基因工程技术
37 发酵工程阶段？菌种选育（上游技术）、 微生物发酵生产（中游）、 产品下游加工
38 发酵液预处理方法和技术有哪些？预处理目地: 改善发酵液性质以利于固液分离常见酸化、 加热、 加絮凝剂方法去除Ca+/Fe+等, 加入草酸或草酸钠。去除杂蛋白质, 加入三氯乙酸盐。去除有色杂质, 加入活性炭。技术: 采取凝聚——絮凝技术凝聚: 在中性盐作用下, 因为双电层排斥作用降低使胶体体系稳定。絮凝: 再一些高分子絮凝剂存在下, 形成絮凝团。物理作用搜集液相, 产品在液相中。提取胞内产物先要对细胞进行破碎。
39 发酵工程下游中提取和精巧？提取: 沉淀法、 萃取法、 离子交换法、 吸附法、 超滤法。精巧: 层析法, 吸附层析, 凝胶层析, 离子交换层析、 聚焦层析、 疏水层析、 亲和层析
40 优良产酶菌种筛选: 繁殖快, 产酶量高, 有利于缩短生产周期; 能在较经济底物上生长良好; 产酶性能稳定, 菌株不易退化, 不易受噬菌体侵袭; 产生酶轻易分离纯化; 不是致病菌, 是不产生有毒物质和其她生理活性物质微生物, 确保酶生产和应用安全。
41 理想宿主条件: 所期望酶占细胞总蛋白量百分比要高; 菌体易大规模培养, 生长无特殊要求, 且能利用廉价原料, 载体与宿主相容, 克隆酶基因载体能在宿主中稳定维持; 宿主蛋白酶尽可能少, 产生外援酶不会被快速降解; 宿主菌对人安全, 不分泌毒素。
42 酶工程培养基: 碳源, 氮源, 无机盐类, 生长因子, PH
发酵工程: 碳源, 氮源, 无机盐类和微量元素, 生长因子, 水, 产物形成诱导物前体和促进剂。
43 酶固定化: 酶与不溶性杂体结合, 将酶限制到一定空间范围内进行催化。
44 在生产酶过程提升酶产量？1）添加诱导物（2）添加促进剂（3）控制阻遏物浓度: 代谢终产物、 分解代谢产物
45 酶分离纯化过程。（1）材料预处理: 预防蛋白酶水解作用分离细胞器, 除去核酸。（2）细胞破碎: 机械匀浆法, 超声波法, 冻融法, 渗透压法, 酶水解法。（3）酶抽提, 用稀酸稀碱盐浸泡抽提（4）分离纯化 沉淀分离法、 层析法、 电泳法、 离心法
46 固定化酶: 经过物理或化学方法将酶束缚在一定空间里, 将酶制成仍含有催化活性衍生物。其优点是: （1）能够使反应过程管道化、 自动化, 产物易从反应液中收回。（2）酶稳定性有所改善（3）酶作用效率提升。
47 设计酶反应器要遵照标准。总体要求: 通用、 简单、 易操作、 损耗低。（1）依据全部酶和底物酶促反应及温度、 压强、 PH等原因对反应影响而设计。(2)依据酶反应中流体、 流动状态以及导热特征选择设计酶反应器。（3）依据生产规模、 生产量和工艺步骤设计。（4）在综合考虑酶生产步骤辅助过程以及二者相互作用和结合方法基础上努力争取使整个实施经济、 社会、 时间、 空间最优化。
48 怎样选择一类酶反应器（1）依据固定化酶形状来进行选择（2）依据底物物理性状来进行选择（3）依据酶反应动力学特征来进行选择。（4）依据酶稳定性来进行选择（5）依据操作要求以及反应器费用来进行选择
49 DNA凝胶电泳检测原理: 以琼脂糖为支持物, 在合适条件下对带电生物大分子进行电泳技术, 关键用于DNA分子分离纯化判定, DNA在其带电点平pH溶液中带负电, 在电场中向正极移动, 因为DNA分子分子质量差异, 电泳后不一样大小DNA分子展现出迁移位置差异, 把已知分子质量DNA与待测DNA同时电泳, 比较二者在凝胶板上所展现出区带, 就能够判定出分子大小。
49 列举发酵工程应用范围。（1）微生物菌体发酵, 以微生物菌体细胞为产品（酵母、 菌体蛋白、 疫苗）（2）微生物发酵（微生物种类多, 产酶多, 成本低）（3）微生物代谢产物发酵（产量最多）（4）微生物转化发酵（利用微生物细胞酶或酶系把一个化合物转化成结构相关更含有价值化合物生化反应。如抗生素生物转换）（5）现代生物技术中生物细胞发酵（6）微生物处理废水以及其她发面发酵。
50 作物转基因育种有哪些优势？A、 扩大了作物育种基因库: 转基因育种打破了常规育种物种界限, 起源于动植物和微生物有用基因都能够导入作物培育成含有一些特殊形状新型作物品种b、 提升了作物育种效率, 缩短育种年限, 单一性状改良c、 减轻了农业生产对环境污染, 能够降低化学杀虫剂对棉衣及天敌伤害, 大幅度降低用于购置农药和虫害防治费用。另外, 农用化肥利用率将极大提升, 这对于有效降低农田土壤中化肥污染含有主动意义d、 拓宽了作物生产范围, 转基因作物提供农产品范围得到了极大地拓宽, 多种有价值蛋白产品都能够利用职务反应器进行高效生产。另外, 转基因作物还能够用来生产多种工业原料, 比如纤维素、 海藻糖和可降解塑料等
51 植物转基因有哪些方法技术？其各自原理是什么？A、 农杆菌介导法: 中间表示载体构建好以后, 将它转移到还有经改造过Ti质粒农杆菌中, 实现转化植物细胞功效, 称为工程农杆菌。经过农杆菌植物受体细胞共培养一段时间, 使农杆菌对植物发生感染, 并将带有外源基因T-DNA片断转入到被感染受体细胞, 从而取得转化体, 在经过合适筛选方法选出转化体, 进而将其培养成转化植物。B、 基因枪法: 利用火药爆炸、 高压放电或高压气体做驱动力, 将载有外源DNA金粉等金属微粒加速, 射入受体细胞或组织, 从而达成将外源DNA分子导入细胞中目。C、 花粉管通道法: 授粉后, 外源DNA能沿着花粉管渗透, 经过株心通道进入胚囊, 转化尚不含有正常细胞壁卵、 合子或者早期胚胎细胞D、 其它方法: 聚乙二醇法: PEG是一个选择性化学渗透剂, 能够使细胞膜之间或使DNA与膜形成份子桥, 促进相互间接触和粘连, 并可经过改变细胞膜表面电荷, 引发细胞膜透性改变, 从而促进外源大分子进入原生质体。显微注射法: 利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞, 并使其成活、 增值而发成为转基因个体。激光介导法、 脂质体介导法。
52 PCR反应原理？PCR由变性--退火--延伸三个基础反应步骤组成: ①模板DNA变性: 模板DNA经加热至93℃左右一定时间后, 使模板DNA双链或经PCR扩增形成双链DNA解离, 使之成为单链, 方便它与引物结合, 为下轮反应作准备; ②模板DNA与引物退火(复性): 模板DNA经加热变性成单链后, 温度降至55℃左右, 引物与模板DNA单链互补序列配对结合; ③引物延伸: DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶作用下, 以dNTP为反应原料, 靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理, 合成一条新与模板DNA 链互补半保留复制链反复循环变性--退火--延伸三过程, 就可取得更多“半保留复制链”, 而且这种新链又可成为下次循环模板。每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目基因扩增放大几百万倍。
53 Ti质粒生物学特点和在基因工程中作用？特点: Ti质粒是在根瘤土壤杆菌细胞中存在一个染色体外自主复制环形双链DNA分子, Ti质粒结构包含毒性区（该区段激活T-DNA转移, 使农杆菌便显出毒性）、 T-DNA区（在侵染植物体时, 从Ti质粒切割下来转移到植物细胞中去, 其上大部分基因只有植物组中才能激活表示）、 结合转移区（该区段上存在着与细菌进行结合转移相关基因）、 复制起始区（确保其进行自我复制）。作用: 该质粒能够将外源基因导入到植物受体细胞当中。
54 原核表示真核基因困难和构建原核表示载体策略？困难: a、 细菌RNA聚合酶不识别真核基因开启子吧、 真核基因转录mRNA缺乏SD序列, 在原核细胞中不能结合在核糖体上c、 真核基因通常含有内含子, 而原核细胞没有像真核细胞那样转录加工系统, 所以mRNA中内含子部分不能被切除, 不能形成成熟mRNA, 也就不能表示出有功效真核蛋白d、 表示真核蛋白 在原核细胞中很不稳定, 轻易被细菌蛋白酶降解破坏。策略: a、 将真核基因克隆到一个强大开启子和SD序列下游, 使得真核基因处于原核调控体系中b、 采取真核基因cDNA序列作为构建表示载体目基因c、 构建载体时, 将真核基因插在多个原核密码子后面, 翻译后就得到了原核多肽和真核多肽混合蛋白, 这么就能够避免被原核蛋白酶识别和降解, 最终能够将融合多肽切除。
55 基因克隆载体特征？能在寄主细胞中进行独立复制和表示; 含有1-2个选择标识基因, 如对抗生素抗性基因等; 含有多克隆位点而且可携带外源DNA片段长度范围较宽; 本身分子量较小, 在寄主细胞中拷贝数高, 易于操作和DNA制备。
56 为何说基因工程实际上是精细酶学操作工程？催化DNA多种特异性反应酶是分子生物学家进行DNA操作基础工具, 在分子克隆过程中, 制备好目DNA后, 下一布就是使用限制性核实内切酶将待克隆DNA片段切割下来, 与特异性切割载体在DNA连接酶作用下连接形成重组分子。这一系列操作不仅用到了限制性核实内切酶和DNA连接酶, 而且还需要DNA聚合酶, 核酸外切酶, 多核苷酸激酶和碱性磷酸酯酶等参与, 以提升特异性DNA片段连接效率。
57 举例说明在基因工程中修饰性工具酶含相关键用途。A、 末端脱氧核苷酸转移酶: 末端脱氧核苷酸转移酶是一类不依靠于DNA模板DNA聚合酶; 该类酶能够在没有模板链存在情况下, 将核苷酸连接到DNA3‘ 羟基端, 尤其是对平末端双链DNA末端加尾十分有效; 最常见用途是在酶切产生平末端, 方便产生粘性末端。B、 S1核酸酶: 在cDNA合成过程中, 切开其发夹结构; 载体构建过程中, 切去DNA片段单链尾巴。C、 碱性磷酸化酶: 在用P标识DNA5‘端前, 去掉5’端P, 预防载体本身环化, 形成二聚体; 用于DNA重组技术中, 去掉DNA5‘端P。
58 植物转基因育种比常规育种有哪些优势以及转基因育种不足？优势: （1）扩大了基因育种基因库, 打破了常规育种物种界限（2）提升了作物育种效率, 缩短了育种年限单一性状改良3）降低了农业生产对环境污染（4）拓宽了作物生产范围。不足: 转基因在技术上比较复杂, 要求较高。
59 连接酶: 能够催化双链DNA片段3’、 5’末端形成磷酸二酯键酶。
目基因: 在基因工程设计和操作中, 被用于基因重组、 改变受体细胞性状和取得预期表示产物基因成为目基因。
细菌质粒载体: 是存在于细菌细胞质中一类独立位于染色体外能够进行自主复制遗传成份。
噬菌体载体: 把专门感染了细菌病毒称为噬菌体载体, 由DNA（头部）和蛋白质（尾部）组成。
溶源: 若噬菌体侵入宿主细胞后并不裂解宿主细胞, 而是把本身DNA整合到宿主细胞DNA中, 并伴随宿主细胞分裂而增殖。
裂解: 若噬菌体侵入宿主细胞后, 能够利用宿主细胞酶以及底物合成新噬菌体, 然后破裂细胞释放出子代噬菌体并再次感染其她宿主。
基因重组: 利用限制性内切酶和其她部分酶类, 切割和修饰载体DNA和目基因, 将二者连接起来, 使目基因插入于能够自我复制载体内, 再转入受体细胞, 以期这种外源性目基因在受体细胞内得到正确表示。
受体细胞: （宿主细胞）是指能够摄取外源DNA, 并使其稳定扩增以及表示细胞。
萨瑟恩DNA印迹杂交: 依据毛细作用原理, 使在电泳凝胶中分离得DNA片段, 转移并结合在合适滤膜上, 然后经过标识好DNA 或RNA探针杂交作用, 来检测这些转移DNA片段。
生能细胞: 是指能够表示生物体基因组任何一个基因, 并能分化该物体内任何一个细胞, 并进而发育成为一个完全生物体细胞。
胚状体: 指组织培养中起源于非核子细胞, 经过胚胎发生与胚胎发育而形成胚状结构。（含有根芽两节）
继代培养: 指愈伤组织在培养基上生长一段时间后, 因为营养缺乏、 水分散失、 代谢产物积累等原因, 需将这些组织转移到新培养基上, 这种转移称为继代培养后传代培养。
植物细胞培养: 指在离体条件下, 将愈伤组织或其她易分散组织接种到培养基, 经过培养使细胞增殖, 从而取得大量细胞群体技术。
组织培养: 是在无菌和人为控制外因条件下, 培养和研究植物组织, 器官, 甚至进而从中分化, 发育出整体植物技术。
人工种子: 外面包裹有一层有机薄膜胚状体。
自然选育: 不经过人工处理, 直接利用微生物自然突变进行选育。（短波辐射、 低剂量使用、 四种碱基磷间互变异构、 宇宙射线？）
固定化酶: 经过物理或化学方法将酶束缚在一定空间里, 将酶制成仍含有催化活性衍生物。
蛋白质组学: 是指一个细胞或组织所包含全部蛋白质, 现将其定义为基因组表示全部蛋白质。
生物芯片: 经过微电子、 微加工技术在平方厘米大小固相基质表面构建一个微型分析系统, 以实现对组织细胞中DNA、 蛋白质以及其她生物组分进行快速、 高效、 敏感高级分析。
基因芯片: 将大量探针分子固定于支持物上后, 与标识样品分子进行杂交, 经过对杂交信号检测分析, 获取样品分子数量和序列信息。
蛋白质芯片: 将大量蛋白质有规则固定到某种介质载体上, 利用蛋白质与蛋白质酶与底物、 蛋白质与其她小分子之间相互作用, 检测分析蛋白质技术。？
人类基因组计划: 目是测定22条常染色体以及1条性染色体上3×109个核苷酸约有3—4万个基因组成全部DNA序列。遗传图谱: 又叫连锁图, 是指以遗传变性遗传标识为“路标”, 以遗传学距离为“图距”基因组图, 它是基于遗传功效而建立图谱。
物理图谱: 是指以一段已知核苷酸序列DNA片段为标志, 所做出基因组DNA分析。
转录图谱: 又叫转录图, 指含有表示能力DNA转录图
序列图谱: 是分子水平上一个物理图谱.
载体DNA与外源基因连接方法有: 粘性末端连接法、 平末端连接法。