天门冬氨酸生产工艺小总.docx

天冬氨酸生产工艺研究进展

一、 天冬氨酸介绍
天冬氨酸(Aspartic acid)又称氨基丁二酸, 是组成机体蛋白质关键氨基酸之一。结构式为: HOOC－CH2－CH(NH2)－COOH, 分子量133.10。它有两种旋光异构体: D型和L型。通常所说天冬氨酸是指等量D型和L型混合物, 为无色单斜棱柱形结晶, 溶于水, 微溶于75%(w/w)乙醇, 不溶于乙醚, 熔点278℃～280℃; L型为无色菱形片状结晶, 溶于水, 微溶于醇, 熔点269℃～271℃; D型溶于水、 盐酸, 不溶于乙醇及乙醚, 熔点251℃。
二、 合成方法
2.1化学合成法
化学法关键用于生产天冬氨酸外消旋体DL-天冬氨酸。
顺丁烯二酸酐和过量氨水与NH4C反应, 反应在一间歇反应釜中, 于140℃、 0.4MPa下反应2.5h。将得到混合物冷却至70℃后用盐酸酸化至pH2.5, 再冷却至室温, 此时天冬氨酸沉淀析出, 将沉淀过滤, 4℃下水洗后得到产品, 产率为55%。
成都有机化学研究所邓润华等采取微波法合成收率为61.4%。该方法采取苯亚甲氨基乙酸乙酯为原料, 在相转移催化剂（TEBA）催化下进行卤化反应, 经水解生整天冬氨酸外消旋体。
, 浙江大学邢亚军等在一钛材高压釜中, 对顺丁烯二酸酐)进行氨化反应合成了DL-天冬氨酸。经过试验研究对原有合成工艺作出了改善, 使产品收率提升到70%以上, 而且对产品分离提纯采取顺丁烯二酸(马来酸)替换盐酸进行酸化结晶从而提升了反应物利用和降低反应剩下物污染。
天津大学王亚权等提出了一个简便、 不使用任何催化剂化学合成法。试验在聚四氟衬里250ml高压釜中进行。试验步骤以下: 将32.5g顺丁烯二酸酐(分析纯)溶于70ml水中, 加入氨水(分析纯)至pH8, 充1MPa氮气, 然后在电磁搅拌下加热至453K, 反应6h, 反应后冷却至室温, 过滤后得无色晶体, 收率63.1%, 熔点338℃。产物红外光谱与DL-天冬氨酸标准谱图吻合, 容量分析表明天冬氨酸含量≥98%。
2.2生物酶法生物酶法
IC法（固定化细胞法或固定化酶法）
1973年, Chibata I等将大肠杆菌中提纯天冬氨酸酶, 包埋在交联聚丙烯酰胺中制成固定化酶, 富马酸和氨水由固定化天冬氨酸酶催化合成L-天冬氨酸。 1974年, Chibata I等深入将高天门冬氨酸酶活力大肠杆菌直接用聚丙烯酰胺包埋, 制成固定化细胞。提升了酶稳定性, 避免了酶提取复杂过程, 首次实现了由富马酸转化为L-天冬氨酸工业化生产, 转化率达成99%, 开创了细胞固定化应用于工业生产先例。
1979年, SatoT等对固定化细胞方法进行了改善, 用天然产物κ-角叉菜胶替换聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌细胞, 并用戊二醛、 戊二醛及环己二胺处理固定化细胞, 以可溶性天冬氨酸酶为对照, 研究了这三种固定化细胞中酶性质。三种固定化细胞酶促反应最适pH为9, 而可溶性天冬氨酸酶最适反应pH为9.5。固定化酶最适温度比可溶性天冬氨酸酶高5℃～10℃。固定化细胞表观Km值大约为可溶性天门冬氨酸酶Km值5倍。细胞经固定化后, 热稳定性得到提升。固定化细胞柱在pH8.5时比在天冬氨酸酶反应最适pH下操作稳定性高。
1981年～1983年居乃琥等利用大肠杆菌菌株, 制备固定化大肠杆菌细胞, 用于连续生产天冬氨酸, 小试每g湿细胞天冬氨酸产量最高可达1007g（30天）。中试每g湿细胞天冬氨酸产量为722g（25天）。该法所用戊二醛浓度和添加量, 比通常方法低。因为戊二醛用量少, 交联不充足, 所以固定化细胞酶活力回收率高, 成本低, 但稳定性较差, 使用寿命短, 所以要合适增加戊二醛用量。
1995年胡永红, 欧阳平凯建立了固定化细胞分离L一苹果酸生产中残留富马酸并将其转化成L-天门冬氨酸新方法。对生成L-天门冬氨酸工艺条件进行优化,结果表明,当L-苹果酸反应液pH调至8~9,L-天门冬氨酸添加量为6-8g/L,碳酸铵加量为15-20g/L,Mg2+、 Mn2+、 Ca2+等二价阳离子加量为1mmol/L时,固定化细胞可将L一苹果酸反应液中残留20%左右富马酸几乎全部转化成L-天门冬氨酸,且L一苹果酸含量损失小于5%。
1996年张波采取三种不一样发酵培养基, 经过不一样发酵时间取样测定酶活(EA)、 pH、 生物量(Biomass), 确定选择培养基A; 经不一样底物浓度、 不一样金属离子对固定化细胞转化率影响试验, 确定使用较高浓度底物及含Mg2+底物为佳, 经试验测得固定化细胞使用寿命为3个月, 即3个月之内能保持转化率在85%以上, 固定化细胞转化时间为3.5h。
1997年石屹峰等[21]设计了用于固定游离细胞生物转化反冲式膜反应器
（图1）, 利用膜将游离细胞阻挡于反应器内, 一样达成固定化目而又不损伤细胞(酶)。菌种采取研究者自己选育含高活力天冬氨酸酶Escherichia coli SF-D4,培养基为1%反丁烯二酸胺,1%玉米浆,0.7%蛋白胨,0.1%KH2PO4, 0.5%(NH4)2SO4,0.02%Mg2SO4。pH 7.2,37℃,摇床培养24 h。细胞离心10,000 r/min、 10 min搜集,用生理盐水洗2次。选择0.22Lm微滤膜, 最好细胞浓度为35 mg/mL。

张今等围绕天冬氨酸酶活性部位、 末端缺失突变、 蛋白质工程菌固定化等方面进行了研究。将突变菌株用琼脂凝胶包埋法进行固定, 固定菌量为95%, 表观酶活力为8单位, 半衰期184d。试验表明, 1kg固定化细胞, 每24h约得L-天冬氨酸30kg,
日本三菱石化企业已用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)发酵法生产L-天门冬氨酸。以往常见细菌是大肠杆菌(E.coli),因它细胞壁脆弱,要循环使用必需将菌固定化于载体上,而该企业所用黄色短杆菌有坚韧细胞壁,故无需用昂贵固定化方法,经离心分离反复可供反应使用。所以,用这种制造方法生产成本下降。
FWC法（游离细胞法或游离酶法）
1996年, 南京化工大学徐虹等使用发酵培养基: 富马酸2%, ,玉米浆4%,KH2PO4;0.2%,MgSO4,0.025%,用氨水调整pH至7.2~7.5。培养温度为37C, 培养时间为26h左右。以大肠杆菌培养液作酶源, 采取游离酶法由富马酸转氨生整天冬氨酸。取培养26h左右培养液, 37℃酶反应6d, 可转化富马酸9kg/L。
, 王雪根、 徐虹等又实现了游离整体细胞法工业化生产L-天冬氨酸, 发酵培养基:富马酸铵0.4%,富马酸钠2.0%,蛋白胨0.9%,牛肉膏0.4%,玉米浆1.4%,KH2PO40.05%,MgSO4#7H2O 0.05%泡敌0.01%;pH 7.0~7.5。发酵工艺: 在摇床上培养5-10 L种子,接种于800 L气升式发酵罐。发酵条件:初始pH 6.5-7.0,风量0.6 VVM,温度37℃,装液量500-550 L。L-天冬氨酸生产步骤见下图。游离整体细胞能够在较短时间内转化为较多富马酸, 且转化较为根本, 转化率平均在99％以上, 有靠近l00％。

北京化工大学唐芳等利用较为廉价水解棉籽蛋白替换蛋白胨作为氮源, 用葡萄糖部分替换富马酸作为复合碳源, 培养产天冬氨酸酶大肠杆菌。结果表明, 改变培养基配比后, 对菌体总体酶活力(即对底物转化能力)影响不大, 转化率可达99%以上, 经过上罐发酵初步估算能够节省培养基碳氮源成本大约60%
2.3生物拆分法
生物拆分法关键用来合成D-天冬氨酸
利用L-Asp-β-脱羧酶进行拆分自然界中含高活性L-Asp-β-脱羧酶微生物较多。该酶能专一催化L-Asp脱除β位羧基生成L-丙氨酸(L-Ala), 所以能够利用该酶把DL-Asp中L-Asp转化成L-Ala, 而取得D-Asp。利用L-Asp-β-脱羧酶进行拆分是现在研究较为成熟一个方法。
韩铭海等提出了一个利用L-天冬氨酸-β-脱羧酶生物转化拆分DL-天冬氨酸得到D-天冬氨酸方法。当牛肉膏浓度为0.2%、 玉米浆为1.0%、 蛋白胨为1.0%时, 发酵液酶活力能够达成最高。转化过程最适pH值为6～7, 转化过程最适温度50℃, 浓度6.0%以上丙氨酸能显著提升转化过程中酶热稳定性。利用D-天冬氨酸和L-丙氨酸等电点差异来分离提取D-天冬氨酸制备工艺。同年, 韩冲等开发了以L-天冬氨酸为原料制备D-天冬氨酸新方法: 以天冬氨酸为原料经过酯化、 消旋、 拆分和水解制备D-天冬氨酸。使L-2, 3-二苯甲酰酒石酸(L-DBTA)与DL-天冬氨酸-β-甲酯在水溶液中于65℃ ～70℃反应形成非对映体盐, 冷却到室温, D-天冬氨酸L-DBTA盐析出, 过滤后再经水解得到D-天冬氨酸, 收率78.2%, 旋光纯度达成99%以上。