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转基因动物在动脉粥样硬化研究
中的应用

转基因动物在动脉粥样硬化研究中的应用
摘要
随着人们生活水平的提高，动脉粥样硬化已经成为威胁人类健康的三大杀手之一。对动脉粥样硬化的研究也成为了当前的热门。目前转基因动物在动脉粥样硬化研究中的应用几乎成为各种国际高水平学术刊物的主流，而转基因小鼠和家兔也因为其独有的特点在心血管研究中占有地位。本文通过介绍转基因动物模型的特点，制备及应用分析了转基因动物对于动脉粥样硬化研究的巨大影响，阐明了基因改造动物动脉粥样研究的优越性及研究近况。文章分析表明转基因动物在动脉粥样硬化研究中有着非常广阔的前景。
关键词
转基因 动脉粥样硬化 动物模型 应用 综述
前言
动脉粥样硬化是动脉硬化的一种，此病发生时大、中动脉内膜出现含胆固醇、类脂肪等的黄色物质，常导致血栓形成、供血障碍等。随着我国人民生活水平的提高，动脉粥样硬化已经成为主要死亡原因之一。近年来，应用转基因动物模型研究动脉粥样硬化的发病机理以及预防和治疗手段已经在这一领域产生了巨大影响。最常应用的有转基因小鼠和转基因家兔。
1常见动脉粥样硬化转基因模型动物的种类及特点
1.1 小鼠 在高血脂和动脉粥样硬化的转基因动物模型的研究中, 小鼠占有重要地位, 其主要原因是由于小鼠除了有遗传学上明确的野生品外, 尚有多种突变型和重组型的品种以及日渐成熟的基因定位技术[1-3]。各种基因敲除和转基因小鼠在研究血浆脂蛋白谱和主动脉病变方面做出了巨大的贡献。尤其是LDL 受体(LDLR) 敲除小鼠,作为人类中引起动脉粥样硬化最常见的疾病- 家族性高胆固醇血症的动物模型,其血浆LDL 可以通过调整食物中胆固醇含量而控制在不同水平,从而诱发出与人类病变更为相近的血管病变。在这两种转基因小鼠的基础上，通过杂交,可以产生不同的转基因、双基因、多基因敲除的小鼠模型。并且小鼠模型的制造成本很低, 采样较方便, 可作为降脂药初筛的模型, 但是采血量少, 限制了指标的检测。
1．2 兔 作为动脉粥样硬化的模型动物, 其优点在于极易形成动脉粥样硬化模型。由于饲料中添加胆固醇容易诱导家兔高胆固醇血症, 家兔是第一个被用于研究人类动脉粥样硬化的动物模型。柳玉霞等[2, 3]报道, 采用高脂饲料喂养法, 家兔2~ 3 周可形成高脂血症, 而大鼠需要4周, 且家兔T C 值增长幅度比大鼠要大。且世代间隔短，繁殖周期快。但家兔是草食动物,和人类的胆固醇代谢不完全一致, 且耗费饲料, 灌胃给药操作不便, 易造成死亡。
2.转基因动物的制备
转基因动物可以定义为, 在基因组中稳定地整合有外源基因, 并由此而具有了新的、可遗传给后代的特征的动物。
2.1转基因小鼠
小鼠是血脂和AS 转基因动物模型研究中最主要的动物, 主要用于调控载脂蛋白基因的表达, 涉及脂质代谢的蛋白主要包括相应的受体, 载脂蛋白( Apo ) 、与脂质代谢有关的酶和转运蛋白[4], 其中ApoE 研究得最多。ApoE 是CM、VLDL、中间密度脂蛋白( IDL) 和部分H DL 的结构蛋白[2, 5], 作为配体与HDL受体和ApoE 受体结合, 介导VLDL、IDL 和CM 残基的清除[2, 6], ApoE 变异或缺乏往往会导致血脂紊乱和AS。琦祖和等[2, 6] 以人的突变性基因载脂蛋白2ApoE7 基因制备了ApoE72Tg 小鼠, 其特点是胆固醇、甘油三酯升高, 脂质代谢紊乱, 小鼠的学习与记忆能力降低, 寿命缩短。Shimano 等[7]采用转基因技术首次制成抗食源性高脂血症的转基因小鼠,他将大鼠ApoE 基因与小鼠金属硫蛋白启动子融合的质粒,用显微注射法注入小鼠受精卵内, 建立了转基因小鼠支系。其中一个高表达力支系的小鼠肝脏中产生了大鼠ApoE。在Zn 诱导后, 该支系纯合子小鼠的血浆中大鼠ApoE 含量比未作诱导的对照组小鼠高得多。王亚楠等[8]建立了脂蛋白脂肪酶和载脂蛋白, 双基因缺陷的混合型高甘油三酯和高胆固醇血症动物模型。
2.2转基因家兔
家兔妊娠期比小鼠长, 制作转基因家兔比制作转基因小鼠要更费时、而且制作过程更加困难。原核显微注射法是目前制作转基因家兔最成功、也最常用的方法, 其它方法仍然局限于小鼠, 还不能完全确定能够应用于转基因家兔生产。 通过显微注射技术将外源DNA 直接注射到受精卵雄原核( male pronucleus) 的方法, 是应用最广泛、最成功的转基因家兔制作方法。采用显微注射法制作转基因家兔与制作转基因小鼠的过程相似, 但也存在一些差别: 家兔受精卵的直径大约是小鼠受精卵的两倍,但是原核的大小与小鼠差不多; 家兔受精卵透明带很厚; 家兔受精卵原核对外源DNA纯度更敏感[9]。
　表1 小鼠、家兔和人在脂代谢方面的比较

3．转基因动物在动脉粥样硬化研究中的进展
目前应用转基因小鼠的研究几乎成为各种国际高水平学术刊物的主流,而基因改造的家兔由于其独有的特点,在心血管研究中占有着重要地位。准基因小鼠和家兔是研究动脉粥样硬化的两种理想的实验动物模型。通过在受精卵中表达RNA 干扰序列而建立的遗传性基因敲下小鼠模型,是近3 年来刚兴起的新技术。目前已经有多个成功报道,并日趋增多[10].2006 年Baylor 医学院Zhang P 研究组在PNAS 杂志(美国科学院学报) 报道了成功应用常规转基因技术表达RNA 干扰序列,制备遗传性基因敲除下小鼠进行遗传性状筛选的研究。这种技术应用成熟、可操作性强,第二代小鼠便可进入筛选,时间上较基因敲除大为缩短。显微注射后4～6 个月的时间,便有可能筛选出特定基因不同抑制水平的子二代小鼠, 。而这些特殊的小鼠模型为科学家发现调控血浆脂蛋白以及动脉粥样硬化发生的机制,创造了有利条件。例如,巨噬细胞中不同的基因在动脉粥样硬化的发生、发展和消退过程中起到非常关键的作用。而利用不同转基因和去基因小鼠作为供体、载脂蛋白E 或LDL 受体缺陷小鼠作为接受体的骨髓移植技术,大大丰富了人们对于巨噬细胞中不同基因在动脉粥样硬化作用的认识。是一种可行性强的平台技术,具有广阔的应用前景。
20 世纪80 年代发展起来的转基因技术大大促进了生物医学的发展。转基因兔模型最早由Hammer 等[10, 11] 1985 年用连接小鼠金属巯蛋白(metallothionein)启动子的人生长素基因制作成功转基因兔,在家兔的血清中检测到了人生长素。1993 年,Hoeg 等[11, 12] 和Perevozchikov 等[11-13] 同时将人载脂蛋白AI 基因导入到家兔的基因组中,培育成功携带人载脂蛋白AI 的转基因兔。 Fan 等[13]培育成功表达人类肝脂酶的转基因家兔，开始使用转基因家兔研究人类脂质、脂蛋白的代谢。转基因家兔模型为研究人类动脉粥样硬化等脂质代谢相关疾病提供了有力工具，开辟了新的研究领域。到目前为止，人类载脂蛋白(a) 、载脂蛋白A-II、载脂蛋白B、载脂蛋白E2、载脂蛋白E3、人卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lecithin cholesterol acyltransferase ，LCAT) 、肝脂酶(hepatic lipase ， HL) 、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase ， LPL) 、15- 脂质氧化酶(15-lipoxygenase，15-LO)、基质金属蛋白酶12 ( matrixmetalloproteinase-12，MMP-12)、血管内皮生长因子、C-反应蛋白(CRP)基因以及家兔的载脂蛋白B mRNA编码蛋白催化多肽1(Apolipoprotein mRNA editingenzyme catalytic polypeptide 1，APOBEC-1)基因等已经在家兔身上表达。此外，人类载脂蛋白(a)、载脂蛋白A-I、人卵磷脂胆固醇酰基转移酶和脂蛋白脂酶基因已经被导入到低密度脂蛋白受体缺陷的内源性高脂血症家兔体内。这些转基因家兔模型为研究人类动脉粥样硬化及其相关疾病的发生、发展提供了新的、独特的方法[13, 14]。利用转基因家兔模型研究动脉硬化发生机制取得了重大进展。如Fan 等[13, 14]和Rouy 等[14]分别建立了表达载脂蛋白(a)的转基因家兔模型。研究发现，在转基因家兔表达的脂蛋白(a)使纤维蛋白溶解的活性推迟，使血浆中血纤维蛋白酶原催化剂抑制子1 的含量增加，脂蛋白(a)还促使平滑肌细胞在动脉粥样硬化病变部位增殖[14, 15]。Huang 等[15]利用过表达人载脂蛋白E2 的转基因家兔研究发现转基因家兔的血浆脂蛋白与Ⅲ型高脂蛋白血症的特征相符，β 极低密度脂蛋白聚集，极低密度脂蛋白和中间密度脂蛋白浓度显著增加，表现出性别差异等。Fan 等[3, 15]研究载脂蛋白E3 转基因家兔发现与非转基因家兔相比，转基因家兔极低密度脂蛋白降低，低密度脂蛋白升高。转基因家兔血浆中几乎没有大的极低密度脂蛋白颗粒( > 36 nm)，而非转基因家兔大约有20 %这种颗粒，差别极显著，可能是载脂蛋白E 增加了受体介导的对极低密度脂蛋白的清除功能。人卵磷脂胆固醇酰基转移酶是胆固醇代谢的一个关键酶。Hoeg 等[3]利用人卵磷脂胆固醇酰基转移酶转基因家兔研究发下人卵磷脂胆固醇酰基转移酶对饲料诱导的动脉粥样硬化有抑制作用。而Mehlum 等[3]研究却发现，携带人人卵磷脂胆固醇酰基转移酶的纯合转基因小鼠的人卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性比对照组高14~27 倍，高密度脂蛋白胆固醇浓度高2 倍，但对饲料诱导的动脉粥样硬化并没有明显的抑制作用。Shen 等[16]利用15-脂质氧化酶转基因家兔证实在动脉粥样硬化早期发生过程中，在单核细胞或巨噬细胞中过度表达15-脂质氧化酶有抑制脂质在血管壁沉积的作用。Cyrus 等[16]研究转基因小鼠却得出完全相反的结论，发现15-脂质氧化酶的功能与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关，15-脂质氧化酶参与脂质过氧化反应和动脉粥样硬化的形成。Liu 等[16]研究发现转基因家兔在表达人脂蛋白脂酶后，胰岛素敏感性显著增加，脂蛋白脂酶基因可能是治疗糖尿病药物的潜在治疗靶位。Koike 等[16, 17]利用C-反应蛋白转基因家兔研究发现，C-反应蛋白不参与动脉粥样硬化的形成和发展。
在中国,由于家兔大小合适,易于喂饲管理,疾病模型与人类相似,因此很多高脂血症和动脉粥样硬化的研究、尤其是相关的中药药效研究,都是在家兔上开展的。
表2 用于脂蛋白代谢和动脉粥样硬化研究的转基因家兔模型

4．转基因动物动脉粥样硬化研究的优点和不足
利用转基因方法建立人类疾病动物模型和用其他方法相比具有许多优点。诸如遗传背景清楚，遗传物质改变简单，建立的模型更自然和更接近病人症状；建立过程操作简便，周期短，而且建立的转基因动物模型不需要特殊的饲养条件即可保持疾病症状，按照孟德尔规律代代相传，维持费相对较代等，但是由于转基因方法和技术上的原因，目前转基因动物模型仍存在一定的问题。譬如有时转基因动物模型缺乏典型的像病人那样的症状；外源基因插入宿主基因组而引起插入突变，破坏宿主基因组基因而产生异常，甚至导致转基因动物的不育和死亡；外源基因在宿主动物染色体上整合的拷贝数不等，单位拷贝的外源基因表达水平不均一，给外源基因的表达控制带来困难；症状严重的还易早死；外源基因在宿主染色体上的部分整合导致外源基因的不表达，不出现预期的严重的还易早死；外源基因在宿主染色体上的部分整合导致外源基因不表达，不出现预期的症状或与预期的结果不符合；有时还会出现整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物模型症状的不稳定遗传等。
5.展望
虽然转基因动物（尤其是TGm）这一生命科学研究的新体系引入到心血管疾病研究领域只有短短十年时间，但已取得了惊人的成果。转基因动物模型在脂代谢障碍与AS病因和发病机理中的研究应用仍然方兴未艾。在生物医学研究中, 虽然家兔模型的应用远不如实验小鼠广泛, 但家兔独特的生物学特性, 决定了它在生物医学研究中有着啮齿类实验动物无法取代的重要价值[17]。与其它家畜( 牛、山羊、绵羊、猪)相比, 家兔体型较小、饲养成本低。近交系( Inbredst rains) 家兔品系也已经培育成功、很多家兔品系也已经实现了SPF 化, 极大的便利了生物医学研究。转基因家兔的一个基本应用价值在于人们可以利用该模型来鉴别基因和相应的调控序列, 以生产生物医学研究需要的人类疾病动物模型, 为我们进一步理解高脂血症、动脉粥样硬化、心脏病、AIDS、肿瘤发生等人类疾病的分子机制开辟了新的途径。同时, 转基因家兔制作和应用研究将增强我们对哺乳动物胚胎学( 如, 胚胎发育异常) 知识, 因为家兔的受精卵较大而易于操作。当然, 我们需要付出更大努力来建立可靠的家兔ES 细胞系以最终生产出基因剔除家兔, 必须选择合适的载体、设计合适的siRNA 从而得到基因封闭家兔模型。在家兔基因组进行基因打靶和基因封闭技术培育转基因家兔品成功之前, 还有许多困难需要克服。在不久的将来, 核移植技术很有可能成为重要的、新的生产转基因家兔途径, 与传统的显微注射技术相比, 体细胞核转移技术用于生产转基因动物的前景是不可估量的。由此可以推测, 在以后的几年通过核移植技术获得的转基因家兔模型将会用于许多生物医学研究项目中。另外, 转基因家兔还是一种有效的生物反应器,可以用来生产重组蛋白。家兔乳汁中蛋白含量是绵羊乳汁的2. 5 倍、山羊4. 8 倍。一只哺乳期的雌兔一天可分泌乳汁170~ 220 g , 一年可产10 kg 的乳汁。作为生物反应器, 与奶牛、绵羊、山羊等转基因家畜模型相比, 家兔模型可能更经济、更有效。目前, 世界上很多实验室和医药公司正在利用转基因家兔模型开发重组蛋白开发[17] 。很多新的或正在发展中的生物工程技术必将对转基因家兔制作产生深远的影响, 我们一定会生产出高效的转基因家兔以满足生物医学研究和重组蛋白生产的需要。转基因小鼠近年来的研究热点是通过以慢病毒载体对造血干细胞中基因的干预,移植到载脂蛋白E 或LDL 受体缺陷小鼠体内,将会使相应研究的深度、广度和速度都得到大幅提高。在脂蛋白代谢紊乱和动脉粥样硬化的研究中,HDL 的作用也是长期以来受到密切的关注。其中清道夫受体B1 (SRB1) 和ABC 家族正成为研究的热点。尤其是多种组织特异性的条件性基因敲除小鼠的建立,把人们对多种基因参与脂蛋白代谢和动脉粥样硬化的认识又进一步深化了。我相信转基因动物模型对于动脉粥样硬化分子机制的探讨和疾病的发病机理、诊断和治疗方面都具有重要意义。

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