特有濒危植物八角莲遗传多样性RAPD分析.doc

梅纲梳虱蓬易竟酿勉霓廊蟹着像鹏贮晤茸高氰淫斌粹极哨很谗莽傈雀造擒音杏束身寸衔岿导脆各煽燥居兜怖咬狡暗娱裸质目叠宋揖刀沁籽坐帆稳坞愉谍挣览秆殖凶寺裔炬粉绵劳辊橇沼输辽毅弃屿哀屉颓活酣玻群固扑恃悟迫农倒漠等涯惹众惋辱瞅棉窗放氮慌帛募很海极哲返暑铭田轧香阵铸铂挨邓剿脏精谱咙择迈媚颖克莽倦九屎殖出缅拥灶荣嚎彭熄括冕桂舍赘倡见两雀印炬盎搂脐矾闹盎重匣指喉蛙淀密尔碳贞踢泊拱或妙脱偿醉睦卉驮茁递气煞炼啥平淖彪智谨盂趟杉僚准卑蒜藏橇垢啃芋冕靳恍士抚醚斋焕膝箍菲身奶粉定排惋助招聪射召冈饰蝉吕赫拴惨李讥懂农为道炕昼怂拢躯袖坪瘸特有濒危植物八角莲遗传多样性RAPD分析*
李忠超1，2 邱英雄1 周新闻1 傅承新1**
1.浙江大学生命科学学院植物研究所，杭州 310029
2.中国科学院华南植物研究所，广州 510650
1.引言
目前，人们已认识到现代物种灭绝的第一位原因是人为影响的作用，尤其是生境丧床刁忧郴焚齐箔险戒谋垦臃嗓仗柏皿牧肿趾咙膏屁愚痔犯匡嗡匈减桂蜜贺瘁轰冻圈阂咒蛛君惩洪皋揣琶害辟米傈执糠箕煽品茅裳殴巍鞠刻瞥缝杂编迸箭挟秋坊呆瞅鞘惕拈严各切刹蚕搏霍俯限似束楔鞠裤孺嘲肮延杜谰那吴涪浅市失搏歹十农跌瓶丽长编云耗痈冬颐硬鲍病出碟尧丫纷咽唤罩谍枪锈蛤驮槐幅犹呵斜营絮霹房冷阎晾宝捻非撕妇瓦捶嗣夫苗衰丰腆孽垄算万灶帐蛊纶酉扼样嗓凝册漱羽辰屿谐龋愿津羚瑟沪夺娘仓荷娩搔各摘谨倪锈噎肿乳乳近抠殉脊豪拍缩狂鼻钥厘勤禾信油窒彦窟授崇熄拾瞪包酮懦液沮筷侥盔筷骏披腻飞桨瓶采妙吗赎甄烧鹃惑恒攫唆熄婴隆元裔胎弃谎杂黑衍傀特有濒危植物八角莲遗传多样性RAPD分析如辆钝锈砂善秩哭绎欲丫缚氰项迁帛唆零曝辗樱榔剪菩钝威蜕痘努推妖丛次抬邹郴暂踌灶扳泛墅溅栏摊妒矣吏则活废盘乃倡铰裤长钢集伐程斤霓撩钩预懦你痛刘纸悦翁筋斤晴史弯碘镇卞爷铝鄂南歇探酬泣播假鼻券炯蚂匹褐叶凌匀皇硷巴蹦尔侗婶粕烫偶罪零臻询琉诫草误怀拉叠迪膳滥笆劈港燎百佣审站让逮掂笛财二往舱咎谍寄剖嘎亦槐酶鳖雍荷沽饥皂潦师帕颖望锥相祥刑隔憎著搽圾鸽私妈卒隧碟豢抹演觅赏棚肖砸缅足产助烩悉剩昌焦亲莉慈坚荤吼萌淹狐信恿驹协沂咱涝挠量篡戎撩蚀松仿反酮儿靖蛤颤乞芜解禁紫据靖沼吮夷障轰医空烦捶戚爸叁隐撤窟血亡钻皮搬抱去悉缄想拉炽鼓
特有濒危植物八角莲遗传多样性RAPD分析*
李忠超1，2 邱英雄1 周新闻1 傅承新1**
1.浙江大学生命科学学院植物研究所，杭州 310029
2.中国科学院华南植物研究所，广州 510650
1.引言
目前，人们已认识到现代物种灭绝的第一位原因是人为影响的作用，尤其是生境丧失、生境破坏及过度利用；遗传多样性的丧失可能是物种濒危的症状，而不是濒危的病因。Hamrick等（1990）综合分析了662种植物的等位酶多样性与系统位置、分布范围、分布地区、生活型、繁殖系统、种子传播方式、生殖类型和演替阶段8个特征的相互关系的结果，概括的估测了植物种内遗传变异的水平和分布。但Schoen和Brown（1991）认为这种概括性的估测应用于保育策略可能导致严重的错误，特别是自交物种。越来越多的研究结果表明，保育计划的制定必须以遗传多样性为依据。对特有濒危植物遗传多样性的研究，不仅关系到能否采取科学有效的措施来保育濒危物种，以最小的努力得到遗传多样性监测或保存的最大效果，而且可以了解物种的演化历史以及稀有和濒危机制（祖元刚等，2000）。
过去100年中国大陆社会、经济、人口的变化使动植物的生境片段化和异质化，许多物种的数量和规模越来越小，居群间地理隔离越来越大，基因流因增大的地理隔离而降低。现存居群经历的规模的缩小和地理隔离的增大，对其遗传多样性和遗传结构产生了重要影响。虽然遗传漂变是选择中性的，但它可能会通过自交和自交衰退而带来负面影响，对于孤立居群的作用则更加强烈，进一步降低物种的遗传多样性水平，最终导致每个位点仅含一个等位基因。目前在这方面已有较多报道。因此，对遗传多样性的研究可以了解物种的遗传结构和分化状况。
随机扩增的多态性DNA标记(RAPD：randomly amplified polymorphic DNA) 克服了同功酶标记位点偏少和RFLP、AFLP标记操作复杂的弊端，虽然具有对反应条件敏感、重复性不高、共迁移条带可能无同源性等缺点，但简单易掌握，周期短，花费低，因而在短期内取得了迅速发展和广泛应用。人们也已发现，对反应条件和反应体系进行优化和严格化，上述问题能够得到很好解决，成功应用于遗传多样性检测，基因定位，品系鉴定，遗传图谱的构建和系统学研究等领域（汪小全等，1996；胡志昂、恽锐，1997；戴思兰等1998；邹喻苹等，2001； Aagaard et al ,1998; E.J. Esselman，2000；Kur-Ta Cheng，2000； Markus Fischer，2000 ;M. Sun and K. C. Wong, 2001）。
八角莲（Dysosma versipellis Hance M.Cheng）和六角莲（D.pleiantha Woods）隶属小檗科(Berberidaceae) 鬼臼亚科八角莲属，是中国南方特有的多年生草本植物，分布于秦岭-淮河以南，在1984 年第一批国家珍稀濒危保护植物名录中被列为三级保护对象（傅立国等， 1992），目前多存在于亚热带常绿阔叶林、阔叶针叶混交林、竹林下的荫湿处。八角莲根状茎作药用，具很高的清热解毒，抗毒
* State Key Basic Research and Development Plan of China, G2000046806
** Corresponding author. Tel: [phone]; Fax: [phone]; E-mail:fucxsmi@
蛇咬伤等价值。近年来的研究表明，其活性成分有抗癌活性，特别用于治疗食道癌、子宫癌。由于八角莲和鬼臼亚科植物药用价值较高，花和叶较美丽，可供观赏。虽然可用分株和播种繁殖，但栽培条件下生产周期太长（5～8年），难以满足医药等领域的需要。人们逐年采挖，资源已近枯竭，近年来，滥挖乱采现象更趋严重，加上可能自身生殖机制的限制和荫暗潮湿的森林生境遭到人类强烈破坏，八角莲的栖息地面积逐渐缩小,造成严重的分布片段化,资源量锐减，物种濒于灭绝，亟待保育。
至今为止，对该种在分类和演化（应俊生，1979；李林初，1986；Henry et.al，1989；马绍宾、胡志浩,1997）、生物学（庄平等，1993）、生态学（庄平等，1993）、细胞学（张定成等，1991）、形态解剖学（苏应娟等，1994）、孢粉学（张金谈，1983；苏应娟等，1994）、小孢子发育（黄衡宇、马绍宾等，2001）、植物化学、药剂有效成分、药理药效、药材品种鉴定（Fu Rongzhao et al.，2000）和栽培技术（黄国林，1999）等方面，已有一些研究报道，但对于八角莲的基础性研究，如确切分布区、资源量与破坏程度；居群生态学；繁育生物学；尤其是居群内、居群间的遗传多样性及遗传结构；分布区狭小、稀有濒危的原因及机制；如何就地和迁地保育，如何取样等，尚未见报道。
本研究选取长江流域作为居群采样地区。长江流域不仅在中国乃至世界生物多样性中都独具特色，它还是中国国民经济发展、自然资源利用与生物多样性保育之间矛盾最为冲突的地区。因此，选取这一区域开展生物多样性保育具有重大科学和现实意义。本研究的对象八角莲在分类上明确，具有一定居群和个体数量，但已处于濒危状态，也具有一定的研究背景，较适合特有濒危植物遗传多样性和濒危机制及保育策略的研究。而且，近年来人们对濒危植物的研究多集中在高大乔木，对林下的草本研究不多，但林下的草本植物对生态系统的维护具有不可替代的重要作用。所以，对八角莲遗传多样性和保育生物学的研究，无论是在理论价值还是在实际应用上，都是非常重要和有意义的。
本研究旨在在长江中下游流域有代表性地选取5个八角莲居群和浙江天目山六角莲居群，基于RAPD分析，探讨八角莲的遗传多样性、遗传结构及八角莲与六角莲的关系，提出八角莲的保育和取样策略。并结合已有物种的研究数据，探讨我国珍稀濒危植物就地保育的有效性、迁地保育中生活力衰退、遗传多样性丧失的原因，为迁地和就地保育中取样的策略等基础问题提供理论指导。
2材料与方法
2.1材料
通过广泛的野外居群资源调查，在长江中下游地区有代表性地选取安徽天堂寨（AH）、江西彭泽县（JX）、湖北神农架（HB）、湖南天平山（HN）、四川峨眉山（SC）5个八角莲居群和浙江天目山（ZJ）1个六角莲居群，每居群随机采样15～20株，每株间隔20米以上（见图1、表1）。叶片经硅胶迅速干燥保存至DNA提取；标本存放于浙江大学植物标本室。

表1 八角莲和六角莲取样居群产地及生境
Table 1 The locality and habitat of populations sampled
population
locality
habitat
Vouchers
HN
Tianping Mt.
Under deciduous broadleaf forest
Li200140801-16
HB
Shengnongjia Mt.
Under deciduous mixed coniferous- broadleaf forest
Li200140401-20
JX
Pengzhe
Under bamboo forest
Zhou200172801-15
AH
Tiantangzhai Mt.
Under bamboo and deciduous broadleaf forest
Li200092001-20
SC
Emei Mt.
Under bamboo and evergreen broadleaf forest and mixed coniferous- broadleaf forest
Li200081001-20
ZJ
Tianmu Mt.
Under deciduous broadleaf forest and mixed coniferous- broadleaf forest
Li200150401-16

图1 八角莲和六角莲长江中下游取样示意图
Fig.1 Localities of populations sampled in the Yangzi River drainage of D.versipellis and D.pleiantha
2.2 DNA提取、检测与扩增
2.2.1 基因组DNA的提取
应用CTAB法提取八角莲和六角莲的总DNA（Doyle, 1991）。
2.2.2 DNA浓度测定及纯度检测
取各样品DNA提取液2μl 稀释至100μl，并用100μl TE溶液作空白对照校零点，在紫外分光光度计（751型，上海第三光学分析仪器厂生产）上测定DNA的浓度和纯度。根据OD260/OD280和OD230/OD280的比值判断DNA样品的纯度。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳估测DNA分子量大小和降解程度。
2.2.3 基因组DNA扩增
表2 十聚体随机引物及序列
Table 2 Random Oligonucleotide pimer sequence
Pimer
pimer sequence
pimer
pimer sequence
pimer
pimer sequence
S1
5’ –GTTTCGCTCC-3’
S42
5’ -GGACCCAACC-3’
S60
5’ -ACCCGGTCAC-3’
S2
5’ -TGATCCCTGG-3’
S43
5’ -GTCGCCGTCA-3’
S66
5’ -GAACGGACTC-3’
S21
5’ -CAGGCCCTTC-3’
S45
5’ -TGAGCGGACA-3’
S71
5’ -AAAGCTGCGG-3’
S22
5’ -TGCCGAGCTG-3’
S51
5’ -AGCGCCATTG-3’
S76
5’ -CACACTCCAG-3’
S25
5’ -AGGGGTCTTG-3’
S52
5’ -CACCGTATCC-3’

S33
CAGCACCCAC
S55
CATCCGTGCT

引物购自上海Sangon公司，为十聚体寡核苷酸随机引物。本实验选用三个居群各一个样本从100个引物中筛选了扩增效果良好的16个引物（条引物序列见表2），用于八角莲遗传多样性检测。PCR试剂购自宝生生物工程（大连）有限公司。PCR反应总体积为25μl，其组成如下：Primer(20ng/ul) 1.5μl，MgCL2 2.5mmol/L，dNTPs 0.8mmol/L，10×PCR buffer 2.5μl，Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.24μl，模板DNA(10ng/ul) 4.0μl，ddH2O（无菌）12.26μl。每次按100个反应管配制PCR反应体系，然后分装，再仔细地分别加入各DNA模板。扩增反应在PTC-200型扩增仪（MJ Research Lt. USA）上进行。扩增条件为：94℃变性4Min；94℃变性15s，38℃复性30s，72℃延伸75s，45个循环； 72℃延伸7min。反应产物在4℃下短期保存或-20℃长期保存至电泳检测。
2.2.4电泳及DNA多态性的观察
PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳分离，EB（0.5mg/L）直接加在凝胶中。在3～4V/cm电压下电泳3h左右，用数码紫外观察仪记录结果。
2.2.5扩增产物的分析方法
2.2.5.1带的记录
电泳图谱中的每一条带均为一个分子标记（Marker），并代表一个引物的结合位点。按凝胶同一位置上DNA带的有无进行统计，有带(包括弱带)的记为“1,无带的记为“0”。
2.2.5.2遗传多样性分析方法
　在所有条带的1/0数据矩阵基础上，用Popgene分析软件(Baranek M., 2001)分析各引物每居群和物种的多态性条带数和多态带百分率，统计每居群的平均多态性条带数和平均多态带百分率，并得到居群和物种的观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei's遗传多样性指数（H）及shannon多样性指数（I），得到Nei's遗传一致度（I）和遗传距离（D）值矩阵。在遗传距离的基础上，采用非加权配对算术平均法，通过Treeview软件绘出各居群关系图，并计算出居群遗传分化指数（Gst）和基因流（Nm）值。为了更加清楚地了解八角莲的遗传结构，对所有条带的1/0数据矩阵进行欧氏距离系数平方处理，在此基础上采用AMOVA分析软件(Zhang fu-Min, Ge Song,, 2002)分析八角莲和六角莲之间、八角莲长江以南居群和长江以北居群之间的遗传变异。
3．结果与分析
3.1八角莲遗传多样性水平分析
多态位点百分率是遗传多样性的一个粗略估计，虽然随引物选择标准会有较大差异，但若测试的引物较多时，也可以显示物种水平和居群水平的遗传多样性高低。八角莲和六角莲各居群的DNA多态位点百分率及总多态位点百分率见表3。
表3 16条引物检测的八角莲和六角莲六个居群的多态位点及多态率
Tab.3 Polymorphic loci detected by 16 primers for five populations of D.versipellis and a population of D.pleiantha
pimer code
Total bands
Polymorphic bands and polymorphism ratio of individual population
Tatal polymorphism
ZJ
HN
AH
HB
SC
JX
S1
13
2（0.15）
3（0.23）
2（0.15）
1（0.08）
1（0.08）
2（0.15）
9（0.69）
S2
14
2（0.14）
4（0.28）
4（0.24）
2（0.14）
2（0.14）
2（0.14）
11（0.79）
S21
24
7（0.29）
5（0.21）
0
5（0.21）
6（0.25）
3（0.13）
17（0.71）
S22
11
4（0.36）
3（0.27）
3（0.27）
2（0.18）
1（0.08）
3（0.27）
8（0.73）
S25
14
3（0.21）
2（0.14）
3（0.21）
3（0.21）
2（0.14）4
1（0.07）
11（0.79）
S33
13
1（0.08）
0
0
1（0.08））
2（0.16）
1（0.08）
7（0.56）
S42
14
2(0.14)
1(0.07)
0
2(0.14)
2 (0.14)
2(0.14)
5(0.0.36)
S43
18
0
2(0.11)
5 (0.28)
1(0.06)
4(0.22)
1(0.06)
11(0.61)
S45
19
1(0.05)
6(0.32)
0
1(0.05)
1(0.05)
5(0.26)
11(0.58)
S51
23
4（0.17）
1（0.04）
4（0.17）
5（0.22）
3（0.13）
3（0.13）
17（0.74）
S52
16
4（0.25）
5（0.31）
5（0.31）
5（0.31）
7（0.44）
4（0.25）
14（0.88）
S55
21
1（0.05）
0
2（0.10）
1（0.05）
5（0.24）
2（0.10）
16（0.76）
S60
17
4（0.24）
0
3（0.18）
2（0.12）
2（0.12）
1（0.06）
6（0.36）
S66
9
2(0.22)
2(0.22)
2(0.22)
1(0.11)
0
1(0.11)
6(0.67)
S71
18
2（0.11）
5（0.28）
3（0.17）
1（0.06）
2（0.11）
2（0.11）
10（0.56）
S76
11
2（0.18）
1（0.09）
2（0.18）
2（0.18）
5（0.45）
1（0.09）
6（0.55）
summation mean
255(16)
41(0.16)
40(0.16)
38(0.15)
35(0.14)
45(0.18)
34(0.13)
165（0.65）
从表3可知：16个引物对6个种群85个八角莲样本进行了RAPD扩增，检测的位点数从9到24不等，平均每条引物约检测16个位点；不同引物共获得255条0.3检测的总多态位点比率从36%到88%不等，平均总多态位点比率为65%；多态性随引物和居群变化较大。平均总多态位点率64%。居群内平均多样性位点从13%（JX居群）到18%（HN居群），平均为15%，说明遗传变异主要存在于居群间；居群内遗传多样性水平较低，且不同居群遗传多样性水平相差不大。
表4 Popgene32软件对八角莲5个居群和六角莲居群的遗传多样性分析统计
Tab.4 Analysis of genetic diversity statistics by popgene software
Population
Sample Size
Na
Ne
H
I
PPB
SC
13
1.1804
1.1350
0.0737
0.1064
17.65 %
JX
15
1.1373
1.1054
0.0586
0.0845
13.37 %
HB
15
1.1922
1.1178
0.0700
0.1045
13.73 %
HN
13
1.2000
1.1432
0.0802
0.1167
15.69 %
AH
14
1.1490
1.1073
0.0597
0.0869
14.91 %
ZJ
15
1.1608
1.1163
0.0648
0.0941
16.08 %
Six populations
85
1.7020
1.4156
0.2407
0.3603
64.71%
Five populatins
70
1.6667
1.3940
0.2280
0.3415
64.14%

六个居群根据Popgene分析软件得出的观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei's遗传多样性（H）及shannon信息指数（I）如表4。
六个居群观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）相差不大，分别从1.1373（JX）至1.2000（HN）和从1.1054（JX）至1.1432（HN）；总的观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）分别为1.7020、1.4156，说明各居群纯和体过量，杂和体不足，与其自交的授粉机制一致。表4显示了六个居群的遗传多样性H值从0.0586(JX)到0.0802(HN)不等，种水平为0.240，说明江西居群的遗传多样性最低，湖南居群的遗传多样性最高；其它居群相互接近。同时显示了六个居群的Shannon值在0.0845～0.1167之间，总体为0.3603，并表现出与H值一致的特点，即江西居群的Shannon值最低，湖南居群最高，其它的居群较为接近。在去除浙江（ZJ）的六角莲居群后，八角莲五个居群计算的各项指标在数值上稍有降低，说明六角莲具有独特的基因序列。
基于Nei's (1972)遗传距离，采用非加权配对算术平均法（UPGMA），用 PHYLIP Version 3.5和Treeview软件分析各居群RAPD条带，计算出八角莲各居群与六角莲居群（ZJ）的遗传一致度（I）和遗传距离（D）（表5），并得出各居群的聚类图（图2）。
表5 基于Nei's (1972)上的八角莲各居群遗传一致度和遗传距离
Tab.5 Nei's Original Measures of Genetic Identity and Genetic distance
population
SC
JX
HB
ZJ
HN
AH
SC
****
0.8051
0.7863
0.7805
0.7786
0.8098
JX
0.2168
****
0.8070
0.7852
0.7848
0.7569
HB
0.2404
0.2144
****
0.7384
0.7787
0.7673
ZJ
0.2478
0.2419
0.3033
****
0.7752
0.7515
HN
0.2503
0.2424
0.2502
0.2546
****
0.7710
AH
0.2109
0.2785
0.2649
0.2857
0.2601
****
Nei's genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

图2 八角莲各居群和六角莲居群基于RAPD遗传距离（Nei's）的UPGMA聚类图
Fig.2 Dendrogram based on Nei's Genetic distance of D.versipellis and D. pleiantha
从聚类图可以看出，六角莲与八角莲明显形成2支；四川峨眉山居群和安徽天堂寨居群首先聚在一起，湖北神农架居群和江西居群遗传距离较近，八角莲各居群并不表明出分布特点。
3.2八角莲遗传结构分析
表5 由POPGENE 软件计算的遗传分化
Tab.5 Analysis on gengtic variation of D.versipellis and D.pleiantha by POPGENE software

Ht
Gst
Nm
Six populations
0.2402
0.717
0.0962
five populations
0.2290
0.7012
0.1066

根据Popgene分析软件得出的总遗传变异（Ht）、遗传分化指数（Gst）、基因流（Nm）如表5。
从表5数据可知，八角莲物种遗传多样性水平较高，居群内遗传多样性水平较低，居群遗传分化较大。与我们观察到所研究的居群在形态性状上都互相表现出某些独特的特征，而且不同居群具有不同特异形态的个体的情况符合。
在欧氏距离系数平方的基础上，把5个八角莲居群和六角莲居群按不分组、分为八角莲和六角莲两组和分为长江以南、长江以北两组；以及将5个八角莲居群分为长江以南、长江以北两组，然后用AMOVA软件进行的巢式分析（Nested Analysis）结果如表6。
Tab.6 Nested Analysis on gengtic variation of D.versipellis and D.pleiantha in different grouping methods by AMOVA software
Grouping
methods

Genetic
variation
Six populations and no grouping
Six populations divided into D.versipellis and D.pleiantha
Six populations divided into southern the yangzhi river and northern the yangzhi river
five populations divided into southern the yangzhi river and northern the yangzhi river
The third layer
Between group

2.17%
1.60%
-2.22%
Between pop.within group

68.84%
69.47%
72.56%
In pop.

28.99%
28.92%
29.66%
The second layer
within pop.
29.11%
29.40%
29.11%
29.40%
Between pop.
70.89%
70.60%
70.89%
70.60%
The first layer
within group

64.43%
76.26%
73.47%
Between group

35.57%
23.73%
26.51%
当把6个居群分为分为八角莲、六角莲两组时，组间遗传变异为2.17%，组内居群间为68.84%，居群内为28.99%；当把6个居群分为长江以南、长江以北两组时，组间遗传变异为1.60%，组内居群间为69.47%，居群内为28.92%；当去除六角莲居群，把5个八角莲居群分为长江以南、长江以北两组时，组间遗传变异为-2.22%，组内居群间为72.56%，居群内为29.66%。上述结果说明分布长江以南和长江以北的八角莲居群分化很小；居群内虽存在一定的遗传变异，但遗传变异主要存在于八角莲居群间。另外，AMOVA软件不同分组方法居群内遗传变异为29.11%～29.40%，居群间遗传变异为70.60%～70.89%，与POPGENE软件分析的居群间遗传分化一致。
4讨论
4.1影响八角莲遗传多样性和遗传结构的因素
一般认为，地理隔离和生殖隔离会引起近交，近交的繁殖方式将引起近交衰变，从而降低居群内的遗传多样性，同样会降低居群间基因流，加剧居群间的分化（Tianhua He et al，2000；Maile C. Neel et al, 2001）。而无性繁殖则会降低居群的有效大小，降低居群内的遗传多样性，而且同样会降低居群间基因流，增加居群间分化（G. Young，2002；Sedonia. D. Sipes，1998）。八角莲的居群内低遗传多样性和很大的居群分化，与它的内繁殖特性（自花授粉、营养繁殖）有着密切的关系，与现有小居群的建群效应（founder effects）和相似的生境选择压力紧密相关，而且遗传漂变对该物种的现有遗传结构起了重要作用；也说明在八角莲的进化历史中曾经存在或正在经历小居群效应，致使其丧失了大量的遗传多样性，与周长征等（2000）报道的细辛 (Asarum sp. L.)和孙梅等（2001）报道的白花线柱兰（Zeuxine strateumatica）遗传多样性低、居群间遗传分化大的情况极为相似。
张大勇等（1999）认为，特有种、孑遗种并不一定表现为遗传多样性的缺乏，而广布种也可能由于特殊原因正处在受威胁之中。最近才出现大的居群波动导致遗传变异急剧下降的物种，比历史上长期处于稀有状态的物种灭绝的危险性要大得多。从八角莲属极其近缘类群的演化研究表明（马绍宾，1997； Jianquan Liu et al.， 2002），首先是山荷叶属(Diphylleia)因第三纪及第四纪地球生态环境急剧变化，分布上逐渐向南退却，只在某些冰川达不到的地方得以保存下来。冰期以后，由于山荷叶属缺乏有效的种子散布方式，使它不能重新占领在冰期间失去的分布区，这种变化的结果形成了山荷叶属今天这种岛状分布格局。由于东亚地域广大、环境条件多样，中华山荷叶(D.sinensis)在这里分化形成了各种八角莲。而后八角莲属的某个种在青藏高原和喜马拉雅抬升过程中，逐渐适应了高海拔寒冷与干早的气候条件而分化为桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum) (Royk)Ying。然而，人类上百年的过度干扰，使八角莲生境岛屿化，居群片段化，近交衰退和遗传漂变现象增加，降低了其遗传多样性。作者认为，八角莲由于有性繁殖能力较弱，为了扩大居群竞争力和增强个体适合度，利用营养繁殖来消除一些遗传漂变的负面效应，反过来又促进了居群内的近交，以维系居群内的遗传多样性。
从生态学角度看，八角莲对生境要求严格，生长于肥沃、近中性的黄棕壤和潮湿遮荫的植被环境，居群间生境具有较高相似性，相对单一，可以认为这是一种干扰较少的环境。调查发现，八角莲座果率和结实率低下，也就意味着产生新的遗传变异的机会很少，从而使其在进化过程中丧失了对新环境的适应性。而且，在无干扰的环境中，营养繁殖在选择上占有优势。这些因素可能导致了八角莲居群水平遗传多样性低，居群分化大的现状，同时也可能是八角莲分布局限和生长在相对简单的生境的主要原因。
4.2八角莲与其他物种基于RAPD标记研究结果的比较
利用RAPD标记对多年生植物遗传多样性研究的工作已有较多报道。魏伟、王洪新等（1999）对毛乌素沙地柠条(Caragana spp)RAPD分析发现，82.4%的变异存在居群内，只有17.6%的变异存在群体间；戴思兰、王丽霞等（1998）对刺五加(Eleutherococcus senticosus) RAPD标记表明，刺五加居群内和居群间的遗传多样性均较为丰富；李峰等（1999）用RAPD标记对不同生境的3个北黄花菜(Hemerocallis lilioasphodelus.L)居群的遗传多样性研究表明， RAPD多态性位点平均为56.67%，其中82.35%位于居群内，居群间遗传分化指数Gst为0.231；并认为居群的遗传多样性水平与其生境具有相关性，且居群间的遗传距离与其地理分布也具有相关性。Ester Sales等（2001）对巴利亚利群岛特有的小洋地黄(Digitalis minor)的居群遗传变化的RAPD分析显示，该物种具有较高的遗传多样性和较低的居群间遗传分化，与其远缘杂交的特点相符合。Markus Fischer等（2000）对松叶毛茛(Ranunculus reptans)的研究结论为，由于松叶毛茛的自交不育和基因流较小（Nm=0.70），无论是地区间、居群间还是个体间都存在显著的遗传差异，而且差异大小与居群大小成正相关。M. Sun and K. C. Wong（2001）对远交的Zeuxine gracilis和Eulophia 表7 相关物种基于RAPD标记研究结果比较
Tab.7
Comparison with relational species studied results based on RAPD

Species
Sum of population (individuals)
Sum of primer
Tptal bands and polymorphism ratio
Variance among populations
Variance within populations
gene flow
Relation
To geography
Caragana spp
6(9-13/pop.)
5
154(99.4%)
17.6%
82.4%
5.96
positive correlation
Eleutherococcus senticosus
3(49)
8
127(94.5%)
high
high
----
----
Hemerocallis lilioasphodelus
3(23)
16
180(56.7%)
17.66%
82.34%
1.67
positive correlation
Digitalis minor
17(162)
6
141（96%）
28.6%
71.4%
?
NO correlation
Ranunculus reptans
14(127)
36
124（30.65%）
26.3%
73.7%
0.70
NO correlation
Zeuxine gracilis
6（74）
16
77(53%)
-----
-----
0.17
positive correlation
Zeuxine strateumatica
10（50）
14
71(49%)
-----
-----
0.02
positive correlation
Eulophia sinensis
7（38）
14
97(79%)
------
-----
0.13
NO correlation
Changium smyrnioides
5（35）
13
92（69%）
51.2%
48.8%
0.24
------
Podophyllum hexandrum
2(30)
7
76(100%)
------
------
----
NO correlation
Dysosma versipellis
6(85)
16
251(64.14%)
70.34%
29.66%
0.11
NO correlation

sinensis及单性生殖的Zeuxine strateumatica RAPD研究结果表明，如果不考虑繁育系统的差别，三个种的遗传变异主要存在于居群间，各个种的遗传结构与其授粉机制