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AlphaScreen技术在高通量筛选研究现况分析

本文介绍了AlphaScreen和AlphaLISA在基础药品研发研究和高通量筛选（HTS）方面技术现实状况。
AlphaScreen用于HTS
第二信使检测
Gs偶联GPCR被激活后, 可激活细胞内cAMP 释放, 并引发下游信号转导。AlphaScreen技术用于cAMP检测采取了竞争性试验（Competition Assay）, 示意图以下:

反应体系内供体珠包被了亲和素, 用于偶联上生物素化cAMP; 受体珠表面为anti-cAMP
抗体; 经过生物素化cAMP可将供体珠和受体珠拉近, 单体氧分子得以传输至受体珠, 发生化学反应, 产生光信号。
将细胞裂解液加入反应体系内, 胞内含有游离cAMP同生物素化cAMP竞争性结合抗体, 体系产生光信号降低。

蛋白激酶检测
蛋白激酶是一类磷酸转移酶, 将ATP磷酸基团转移至靶标底物。蛋白激酶关键分为2大家族, 其中一族将磷酸基团转移至蛋白酪氨酸残基上, 称为酪氨酸激酶; 另一族将磷酸基团转移至蛋白丝氨酸/苏氨酸残基上, 称为丝氨酸/苏氨酸激酶。
针对酪氨酸激酶检测, AlphaScreen利用了酪氨酸磷酸化抗体, 这些特异性抗体已偶联于受体珠表面。作为激酶作用蛋白底物, 已经过生物素化处理, 能连接于供体珠表面。

激酶有活性状态下, 利用蛋白底物磷酸化基团能将供体珠与受体珠距离拉近, 单体氧分子得以传输至受体珠, 发生化学反应, 产生光信号。

通常意义上, 丝氨酸/苏氨酸激酶特异性高于酪氨酸激酶, 所以进行检测时, 对于抗体特异性要求更高。在这里, 受体珠表面包被上Protein A（Protein A是一个分离自金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白, 关键经过Fc片断结合哺乳动物IgG）, 用于偶联鼠源或兔源磷酸化抗体; 供体珠能够经过表面包被亲和素偶联生物素化磷酸化多肽或者是经过表面包被谷胱甘肽（GSH）偶联GST标签蛋白底物。一旦多肽或蛋白底物被磷酸化, 将拉近抗磷酸化抗体, 产生光信号。

常见激酶检测方法都需要特异性抗体用于检测磷酸化多肽, 新近又有部分方法采取Lewis 金属螯合物用于螯合底物上磷酸基团。在这里, 磷酸化激酶底物能够经过生物素化或是加上GST标签而偶联在供体珠上, 供体珠表面包被了Lewis金属螯合物。一旦磷酸化底物被Lewis螯合将拉近供体珠和受体珠距离。

与同类型检测方法TR-FRET、 EFC和FP相比, AlphaScreen优势在于蛋白和多肽都可作为磷酸化底物用于激酶检测。

另部分激酶检测方法则是将一对抗体对分别标识在供体珠和受体珠, 与ELISA类似, 形成双抗体夹心法。该检测方法最大优势在于无需进行引物标识, 检测灵敏度比ELISA方法更高。

现在, 激酶检测技术朝着活细胞检测方向发展, AlphaScreen在活细胞激酶检测有着独特优势, 能够检测内源底物磷酸化状态。

蛋白酶检测
AlphaScreen已设计用来检测多个蛋白酶活性, 比如ADAM。供体珠和受体珠分别偶联了抗体针对蛋白多糖（aggrecan）两个不一样抗体表位。当底物蛋白多糖结构完整情况下, 成对珠子距离拉近, 能产生光信号。当ADAM存在情况下, 能打断蛋白多糖完整结构, 光信号强度降低。类似检测方法在小分子高通量筛选中应用很广泛。

蛋白底物被水解后, 供体和受体珠分开, 光信号强度降低
同传统蛋白酶活性检测技术（比如, 基于FRET检测方法）比较, AlphaScreen优势在于能利用较大分子底物, 尤其长片段蛋白底物上存在多个蛋白酶水解位点, 而多肽片段只含有一个水解位点则会错失大量蛋白酶功效信息。

泛素连接酶检测
泛素化是一类翻译后修饰, 由E3连接酶家族调控, 将造成目标蛋白降解。研究已发觉, E3连接酶活性失调与多个疾病发生机理相关（如Alzheimer’s、 Parkinson’s、 癌症、 炎症反应）, 所以E3连接酶是一类关键药品靶标, 传统筛选技术通量低, 并多采取免疫印迹技术。文件已报道使用AlphaScreen技术筛选未知E3连接酶底物, 即经历泛素化修饰未知靶标。该项目筛选连接酶Rsp5底物, 大量未知底物加上GST标签, 以此偶联上受体珠; 体系中加入生物素化泛素; 如Rsp5能作用于底物时, 将生物素化泛素加上GST标签底物, 供体珠亲和素-生物素偶联, 将供体珠受体珠距离拉近, 单体氧分子得以传输, 产生光信号。利用该方法, 此次项目中筛选得到大量首次得到底物, 后续电泳胶试验和细胞毒性检测也证实了这些底物为Rsp5泛素化靶点。

蛋白之间相互作用检测
很多细胞学检测包含到复杂蛋白之间相互作用, 包含配体/GPCR结合, G蛋白偶联, 激酶与底物结合, 以及转录因子同激活子/抑制子之间相互作用。
生长因子受体结合
以TNF受体超家族OX40受体为例, 配体（OX40L）带有生物素标签将偶联至亲和素包被供体珠; 受体（OX40）以融合蛋白形式连上IgG部分Domain, 以此偶联上Protein A包被受体珠; 当OX40L与OX40结合后, 将供体珠和受体珠距离拉近, 单体氧分子得以传输, 产生光信号。在实际高通量筛选中, 已筛选出若干个抑制OX40L结合小分子。
转录因子
AlphaScreen也一样用于转录因子和核内结合位点结合, 比如雌激素受体（ER）和steroid receptor co-activator 1（SRC-1）。ER经过抗ER抗体偶联至受体珠, 多肽片断（SRC-1）生物素化后偶联上供体珠。ER激活剂激活ER后将开启ER和SRC-1相互作用, 产生光信号。诸如上述, AlphaScreen技术用于受体激活剂和抑制剂高通量筛选。
病毒蛋白结合
传染性疾病机理研究中病毒蛋白引发细胞transformation和增殖。比如, 人乳头瘤病毒（HPV）经过抑制p53活性, 抑制细胞经历凋亡, 是cervical癌症关键致病因子。该过程中, HPV蛋白E6与泛素化连接酶E6AP而引发该过程。文件报道使用AlphaScreen检测E6和E6AP相互作用, 以检测二者结合抑制因子。检测体系中, E6-GST标签蛋白结合至受体珠, E6AP生物素化后连接至供体珠。经过该检测平台筛选了约3000种小分子并成功筛选出若干个先导物, 并由后续试验证实。

AlphaLISA
现在, 高通量生物标志物筛选分析对于自动化检测仪器平台要求较迫切, 而现在常见生物标志物分析技术为ELISA。ELISA技术不可避免地需要多个洗涤步骤, 这需要自动化仪器复杂编程, 将增加成本并降低正确性。ELISA技术动态范围为2个数量级, 多数情况下需要对样本进行数次稀释以达成ELISA检测范围内。
AlphaLISA技术作为AlphaScreen延伸, 很好地满足生物标志物高通量筛选需求。检测原理类似于双抗体夹心法, 示意以下:

与ELISA相比, AlphaLISA含有下述特点:

传统ELISA
AlphaLISA
特异性
高
高
灵敏度
灵敏（皮摩尔水平）
高灵敏（亚皮摩尔）
检测特征
非匀相, 需要数次洗涤
匀相, 无需洗涤
人力
非常耗人力
人力需求非常少
高通量
实现高通量较困难
轻易实现微型化
抗体需求
需要高亲和度抗体
能够使用高亲和/低亲和力抗体
上样体系
大, 50~100μl
小, < 5μl
检测范围
有限（2个数量级）
大（4个）
仪器需求
一般微孔板
Alpha检测特殊仪器, 需要激光器

总结
任何技术都是一把双刃剑, 有优势也有限制, AlphaScreen/AlphaLISA技术也不例外。AlphaScreen技术关键限制在于反应体系对于强光或是长时间室内光敏感; 其次, 一些化合物对于单体氧分子捕捉会降低光信号; 供体珠光漂白效应使得信号检测以单次为佳。与ECL、 FMAT技术相同, AlphaScreen也需要高能激光器; 同其她技术相比, AlphaScreen对于检测仪器平台有要求。

AlphaScreen技术关键优势在于待测物质范围宽泛, 从小分子到大型复合物; 均相体系、 快速、 稳定, 灵敏度更高; AlphaScreen检测也不需要荧光标签引入, 避免了空间位阻影响生物分子相互结合; 可用于检测生物学粗提物比如细胞裂解物、 血清、 血浆、 体液等, 而不会影响测读效果。