NY∕T 1981-2010 猪链球菌病监测技术规范(农业).pdf

ICS 11.220 B 41 中华人民共和国农业行业标准NYIT 1981-2010 猪链球菌病监测技术规范The surveillance guideline of swine streptococcosis 2010-12-23发布201个02-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 1981-2010 前本规范遵照GB/T 1. 1-2009给出的规则起草.本规范囱中华人民共和国农业部提出。昌本规范由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口。本规范起草单位中国动物卫生与流行病学中心、广西壮族自治区动物疫病预防与控制中心.本规范主要起草人:范伟兴、王楷应、张喜悦、王幼明、康京丽、黄保续、刘棋、熊毅.I NY/T 1981-2010 猪链球菌病监测技术规范1 范围本规范制定了在全国范围内开展猪链球菌病监测和暴发疫情处理的技术规范，主要适用于散养户的调查、监测。各地可参考本规范，按实际情况开展有针对性的猪链球菌病监测工作。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注目期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。GB/ T 4789. 28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/ T 19915.1 猪链球菌2型平板和试管凝集试验操作规程GB; T 19915.2 猪链球菌2型分离鉴定操作规程GB; T 19915. 3 猪链球菌2型PCR定型检测技术GB; T 19915.4 猪链球菌2型三重PCR检测方法3 术语和定义下列术语和文件适用于本文件.3.1 猪链球菌病swine st呻MRmis由多种链球菌感染引起的猪传染病.其中，由猪链球菌2型感染所引起的猪链球菌病是一种人畜共患传染病，该病能引致猪急性败血死亡，并能使人致死.3.2 监测surv田1100四对某种疫病的发生、流行、分布及相关因素进行系统的长时间的观察与检测，以把握该疫病的发生发展趋势。3. 3 暴发outbreak 在一定地区或某一单位动物短时期内突然发生某种疫病很多病例。4 常规监测4. 1 目的了解病例的流行形式、感染率、发病率和病死率以及该病畜间、空间和时间的分布情况.4. 2 监测点的选择4. 2. 1 非疫区监测抽样4.2.1.1 养猪场(户)的活体监测按照每个乡镇至少抽检一个行政村的抽样比例，从该县市、区所有行政村中随机抽样确定待抽样村、在待抽样村随机抽样采集该村饲养猪只的扁桃体拭子。每年3月、6月和10月各采集一批。以行政村为单位，每村采样20头.在对被抽样猪只的选择上，原则上只对100日龄以上的存栏育肥猪进行NY!T 1981-2010 采样。对不足20头的村，接实际饲养头数采样。填写采样登记表(见附录A)。4. 2. 1.2 屠宰场(点)散养屠宰猪的监测屠宰检疫应将猪链球菌作为重要检查项目，并详细记录检疫结果，对辖区内的屠宰场(点)的屠宰猪只，随机采集扁桃体样品20份，每年3月、6月和10月各采集一次，并对采样猪只的原场(户)来源做好详细记录，填写采样登记表(见附录A)o4.2.2 曾为自在区的监测抽样近三年有人、猪链球菌病发病或死亡的疫区，需进行以下监测:每年6月在疫点及周围5km范围内，从所饲养的猪只中随机采集30头猪的扁桃体拭子，进行病原学检测;一一若此地区实行猪链球菌疫苗免疫，每年6月和8月分别在疫点周围5km范围内，从所饲养的猪只中随机采集30头猪血清样品，进行抗体监测.填写采样登记表(见附录A)o4. 3 样品采集当地动物疫病预防控制机构的兽医技术人员，按照猪链球菌病样品采集方挝、气见附录助，对病死猪、活猪以及慢性和局部感染病例，分别采集相应样品.4. 4 实验室检测待栓样品送至实验室后，按猪链球菌病实验室检测流程(见附录。，选用适当的方法进行分离鉴定和血清抗体检测.若本实验室不具备实验条件或能力，可送国家指定的猪链球菌病诊断实验室进行鉴定。4.5 结果汇总与分析样品检测结呆填报猪链球菌病病原检测结果汇总表(附录D)，计算猪群的猪链球菌感染率、发病率和病死率，分析疫情发生的可能性与风险因素.5 暴发瘦情监测5. 1 目的确定引起疫情的病原，明确疫情发生范围，详细调查疫点的饲养方式、饲养密度、发病情况、自然地理条件、气象资料等流行病学因素.了解疫点所在地的既往疫情和免疫情况.5.2 病例发现与疲情报告从事动物疫情监测、检验检疫、疫病研究与诊疗以及动物饲养、屠宰、经营、隔离、运输等活动的单位和个人，发现患有猪链球菌病或疑似猪链球菌病暴发疫情时，要立即向当地兽医主管部门、动物卫生监督机构或者动物疫病预防控制机构报告。发现疑似猪链球菌病疫情时，当地动物疫病预防控制机构应及时派员到现场进行突发病例调查(见附录E)，同时采集病料进行检测或送检。动物疫病预防控制机构防疫、检疫人员在对辖区内的猪只进行防疫、检疫和诊疗的过程中，加强对猪链球菌病的诊断工作，发现疑似病例按规定进行剖捡，采集病料送捡，填写病例调查与采样送检单(见附录E)，并做好无害化处理。5. 3 样品采集当地动物疫病预防控制机构的兽医技术人员，按照猪链球商样品采集方法(见附录0)，对病死猪、活猪以及慢性和局部感染病例分别采集相应样品。样品种类依附录D，样品采集数量依当地估计流行率查询暴发疫情采样数量表(见附录F)。5.4 实验室检测同4.405. 5 结果汇总与分析样品检测结巢填报猪链球菌病病房、检测结果汇总表见附录凹，确定引起疫惰的病原是否为链球菌，明确病原的血清群和lil型。必要时，分析流行商株的毒力因子与基因背景，推测I!情发生原因等。口曾为疫区样品编号采样单位=送检人采样日期附录A(规范性附录)采样登记表口养殖场口养殖户口屠宰场)口市规监测口非疫区口屠宰场口养殖场样品种类是否免疫该病疫苗及种类，何时免疫采样人=送栓日期.一一一年一一一月一一一日NY/ T 1981-2010 口疫情监测症状猪只来源地(村)/盲主姓名3 NY!T 19812010 附录B(规范性附录l猪链球菌样品采集、包装、运送猪链球菌样品采集、包装、运送应由经过培训的兽医技术人员进行操作。B. 1 采样器材准备B. 1. 1 防护服、无粉乳胶手套和防护口罩，如活体采样备开口器、长30cm左右的棉拭子等。B. 1. 2 灭菌的剪刀、慑子手术刀、注射器和钊头等。可以清楚标记且标记不易脱落的记号笔、标签纸和胶布等。B. 1. 3 用来采集器官、组织的带麟、口盖塑料笛等灭菌容器。B. 1. 4 血平板和增菌培养液。B. 1. 5 带有冰袋或干冰的冷藏容器。B. 1. 6 样品采集登记表.B.2 样品的采集B.21 养殖场(户)活猪的样晶采集用开口器给猪开口，用灭菌的棉拭子(.约30cm)采集活猪的扁桃体拭子.并随即置于选择增菌培养液(含15周/mL多教菌素B，30周/mL茶皖阂隘的脑心浸液)中，带回实验室进行增商培养，如需进行抗体效价检测.同时采集对应猪的血液5mL，如遇急性菌血症或败血症病例，可无菌采集抗凝全血5 mL。B.2 2 养殖场户)膏j检病死猪的样晶采集无菌采集死亡猪的肝、脾、肺、肾、心血和淋巴结等组织及心血样品，脑膜炎病例还可采集脑脊液、脑组织等样品。B. 2. 3 屠宰场健康猪的样品采集无菌采集屠宰猪的腾扁桃体。B.24 屠宰场脐部急性病变猪的样品采集元菌采集屠宰猪的肺脏。B.3 样晶运输保存与运输B.3 1 装病料的容器要做好标记，并根据所采样品的种类详细填写样品采集登记表。B.32 冷藏容器应包装完好，防止运输过程中破损。B.33 采集的样品如不能马上进行检测，则应立即置于安全密闭的保温容器中冷藏运输。B. 3 4 用来检测的标本可在4C8C冰箱暂放，剩余样品应放置于一20C保存。用于病原检测的样品不可放置时间太长，尽可能在1周内送实验室进行检测，切勿反复冻融。B.4 注意事项B. 4. 1 采样过程应严格无菌操作，采取一头猪的病料，使用一套器械和容器，避免混用，防止样品交叉NY/T 1981-2010 污染.B. 4. 2 应尽可能在解剖现场接种绵羊血血平板和增菌培养液.如无法在解剖现场接种，样品应尽快送实验室，并立即检测.B 4. 3 在标本采集过程中，应穿戴防护用具，注意安全防护，谨防剪、刀、针头等锐器和j伤。5 NY/T 1981-2010 (1 病料的触片镜检附录C(规范性附录)参考方法用灭菌刀片或剪刀将病料组织做一新切面，然后在载破片上做组织触片，姬姆萨染色(按GB/T4789.28规定的方法进行染色)后镜检，检查视野中是否有蓝紫色链状球菌。(2 链球菌分离鉴定(2 1 病料或扁桃体的培养(2. L 1 直接分离用火焰灭菌并冷却的接种环蘸取样品内部组织后，如j线接种于绵羊血琼脂平板，于37(:培养16h-20 h。如菌落生长缓慢，可延民至4 6h-50 h后观察.(2.12 增菌培养元菌采集样品置于脑心肉汤中.37(:增菌培养18h-48 h.接种新鲜绵羊Jl平板，宣37(:培养16 h-20 h。如商落生长缓慢，可延长至46h- 50 h后观察。对污染样品接种选择性增菌培养液05g/mL多教菌素B.30fg /mL茶咬嗣酸的脑心浸液增菌约15h后接种绵羊血平板，或直接划线接种含两种抗生素(15g/mL多教菌素B.30g/mL茶咙嗣酸)的绵羊血琼脂平板.37(:培养22h-26 h后观察.(2.2 扁桃体拭子或抗摄金血的培养扁桃体拭子或抗凝全血1mL加入到含有5mL灭菌的选择性增商培养液试管中，于37(:培养16 h-20 h后，如j线拔种于选择性绵羊血劫、脂平板.37C培养22h-26 h后观察.(2.3 分离纯培养参照GB/T19915.2的规定执行.(2. 4 鉴定( 2. 4. 1 猪链球菌种的鉴定采用纯化后的单商落或液体纯培养或提取的细菌基因组，利用猪链球菌种的特异性引物(推荐使用gdh基因进行检测，若为阳性者如l为猪链球菌(也可先用增菌培养液进行猪链球菌种的鉴定，再进行细菌分离，最终以分离到细菌判为阳性)。( 2. 4. 2 猪链球菌2型的PCR鉴定按照GB/T19915.2的规定执行。( 2. 4. 3 其他血清型的鉴定若属猪链球菌种，但不属猪链球菌2型的病原菌，可送到有资质的实验室进行鉴定。( 2. 4. 4 猪链球菌的毒力因子PCR检测必要时，进行猪链球菌毒力因子的PCR检J!IJ，可检测的主要毒力基因包括溶菌酶释放蛋白基因(mrp)、细胞外蛋白因子基因、溶血素(sly)和orf2等.(3 结果报告样品检测结果汇总后，填报猪链球菌病病原检测结果汇总表(见附录D)。6 NY/ T 1981-2010 C.4 猪链球菌病实验室检测流程见图c.1 待幢样品送王实验室+ 病料触片镜检病料增菌培养(G町T4189坦)细菌分离纯化(GB/T 19915.2) f 革兰民染色镜栓(G/T4189.28) 猪链球菌种鉴定+ + 猜链球菌2型鉴定其他血清型鉴定击+ 图C.l猪链球菌病实验室检测流程7 zd气叶-lMD-D附录规范性附录)猪链球菌病病原检测结果汇总表样品编号猪只来源样品类型分离培养猪链球菌2型若非猪链球菌2型，销链球酶的毒力因于(是:+;否)说明病原鉴定情况结果判定mr ef s/y orf2 省D 月年 填报人g填报单位=填报时间g日月年附录E(规范性附录)病例调查与采样送检单ZJ气4-mw-tJMD-D采样单位样品编号检验单位联革电话来样地点样品收到日期发病日期年月日时死亡时间年月日时检验人送栓日期年月日时取材时间年月日时结果通知日期猪的品种猪舍卫生状况口 良好口一般口较差口很差联系电话病例有关情况猪舍面积猪舍通风情况口良好口一般口较差口很差口是猪链球菌2型同舍猪数猪舍潮湿情况口干燥口较干燥口潮湿口很潮湿商茵全称免疫次数免疫日龄免疫日期实验室病原检测结果口不是猪链球菌2型，商苗免疫状况而是疫点既往疫情、自然地理和气候状况病例的流行形式、发病率，诊断结论畜间、空间和时间分布主要临珍症状主要lJiJ检病变疫点人群感挠、发病情况处理意见初步诊断结果口疑似诊断送输入口临床诊断由NY/ T 1981一2010附录Fl规范性附录)暴发疫情采样数量表估算流行率群体大小0.1% 1% 2% 5% 10% 20% 10 10 10 10 10 10 8 50 50 50 48 35 22 12 100 100 98 78 45 25 13 500 500 225 129 56 28 14 1 000 950 258 138 57 29 14 10 000 2 588 294 148 59 29 14 元穷大2 995 299 148 59 L 29 14 根据(OIE陆生动物诊断试剂与疫苗手册中，试验敏感性和特异性为100%时，要95%至少检出一例感染的样品数的公式计算。10