型糖尿病自身抗体检测.pptx

糖尿病的分型诊断的进展糖尿病的分型诊断的进展n1979年年WHO提出了原发性临床糖尿病分为胰岛素依赖型提出了原发性临床糖尿病分为胰岛素依赖型和非胰岛素依赖型，依赖型与非依赖型的区别主要依据和非胰岛素依赖型，依赖型与非依赖型的区别主要依据胰岛素胰岛素细胞功能受损的程度，临床上是否依赖胰岛素而细胞功能受损的程度，临床上是否依赖胰岛素而言，并不反映其发病本质言，并不反映其发病本质n1997年年WHO建议取消依赖型与非依赖型，改为建议取消依赖型与非依赖型，改为1、2型。型。1、2型的区别要看病因是否由胰岛型的区别要看病因是否由胰岛细胞自身免疫破坏造细胞自身免疫破坏造成，成，1型与型与2型是完全不同的两类疾病，但型是完全不同的两类疾病，但2型非依赖型可型非依赖型可发展成发展成1型胰岛素依赖型，成人缓慢进展型就经历了这个型胰岛素依赖型，成人缓慢进展型就经历了这个过程。过程。第1页/共39页WHO（1997年）建议的糖尿病年）建议的糖尿病分型方案分型方案n 1型糖尿病（型糖尿病（T1DM）胰岛胰岛细胞破坏导致胰岛素绝对缺乏细胞破坏导致胰岛素绝对缺乏：A.免疫型；免疫型；B.特发型特发型n2型糖尿病（型糖尿病（T2DM）胰岛素抵抗为主体的胰岛素相对缺乏，或胰岛素分泌受损胰岛素抵抗为主体的胰岛素相对缺乏，或胰岛素分泌受损为主体的胰岛素抵抗为主体的胰岛素抵抗n其他特殊类型糖尿病其他特殊类型糖尿病n妊娠期糖尿病妊娠期糖尿病 第2页/共39页1型糖尿病的流行病学型糖尿病的流行病学n主要见于主要见于15岁以前的儿童和未成年人；岁以前的儿童和未成年人；n亚洲及我国发病率相对较低（我国儿童中的发病率为亚洲及我国发病率相对较低（我国儿童中的发病率为0.59/10万每年，全国万每年，全国T1DM的总数至少的总数至少200-400万）万）n各国的各国的1型糖尿病较以前有逐年增加趋势；型糖尿病较以前有逐年增加趋势；n不少地区的不少地区的1型糖尿病的发病率与季节有关型糖尿病的发病率与季节有关第3页/共39页1型糖尿病的发病机制型糖尿病的发病机制 遗传易感性遗传易感性 环境因素环境因素 感染、饮食、地理、气候感染、饮食、地理、气候 细胞自身免疫损伤细胞自身免疫损伤 细胞破坏、功能损害细胞破坏、功能损害 胰岛素分泌缺乏胰岛素分泌缺乏 第4页/共39页1型糖尿病的病程型糖尿病的病程细胞量1型糖尿病的病程遗传易感性环境因素胰岛素正常自身抗体阳性血糖正常胰岛素血糖正常应激血糖胰岛素血糖80%细胞破坏胰岛素缺乏临床糖尿病第5页/共39页1型糖尿病和型糖尿病和2型糖尿病的比较型糖尿病的比较 T1DM T2DM 起病起病 急急 进行性进行性 内源性内源性Ins Ins 低或缺乏低或缺乏 正常，升高或降低正常，升高或降低 酮症酮症 常见常见 少见少见 发病年龄发病年龄 各年龄段各年龄段 绝大多数为成人绝大多数为成人 体重体重 通常非肥胖通常非肥胖 肥胖或非肥胖肥胖或非肥胖 治疗治疗 Ins Ins 饮食，口服降糖饮食，口服降糖药，药，Ins Ins 家族史家族史 10-15%30%10-15%30%孪生子发病一致率孪生子发病一致率 30-50%70-90%30-50%70-90%HLA HLA相关相关 HLA-DR,HLA-DQ HLA-DR,HLA-DQ 无关无关 自身抗体自身抗体 多见（多见（85%)85%)少见少见 第6页/共39页1型糖尿病和型糖尿病和2型糖尿病的区分型糖尿病的区分一般一般30岁起病方式急，有者以酮症酸中毒（DKA）发病 酷似非肥胖T2DM，多在病后3年内发生DKA糖耐量减低发病时严重数年后显著或严重伴其他自身免疫病常无可有（Addison，恶性贫血，重症肌无力等）依赖Ins治疗发病后即依赖初期对饮食和/或口服降糖药有效随后依赖胰岛细胞功能发病后即严重受损，血中C肽水平低或侧不出 发病时尚有残存功能，数年后同急性型细胞自身抗体起病时急剧升高，发病后下降，数年后可阴转低水平持续阳性，有人超越10年第8页/共39页抗胰岛细胞抗体抗胰岛细胞抗体(ICA)n1974年年Bottazzo采用间接免疫荧光法在胰岛素依采用间接免疫荧光法在胰岛素依赖性糖尿病患者血清中首次检测到抗胰岛细胞抗赖性糖尿病患者血清中首次检测到抗胰岛细胞抗体（体（islet cell autoantibodies,ICA）。）。nICA是针对胰岛细胞内多种抗原的一组抗体是针对胰岛细胞内多种抗原的一组抗体,其靶其靶抗原至今尚未完全阐明。抗原至今尚未完全阐明。第9页/共39页n与糖尿病相关的自身抗原不仅在与糖尿病相关的自身抗原不仅在细胞表达，这些抗原的细胞表达，这些抗原的组织分布可分为：组织分布可分为：(1)细胞特异的，如胰岛素；细胞特异的，如胰岛素；(2)胰岛细胞特异的；胰岛细胞特异的；(3)神经内分泌特异的，如分子量为神经内分泌特异的，如分子量为65 kD的谷氨酸脱羧的谷氨酸脱羧酶（酶（GAD65kD）、）、ICA512、神经节苷脂、神经节苷脂（ganglioside）、脑硫脂（）、脑硫脂（sulfatides）等；）等；(4)较广泛的分布，如较广泛的分布，如HSP62等。等。目前所知的目前所知的ICA主要抗原的是谷氨酸脱羧酶主要抗原的是谷氨酸脱羧酶（GAD）和酪氨酸磷酸酶（）和酪氨酸磷酸酶（IA2）第10页/共39页检测方法：检测方法：间接免疫荧光法间接免疫荧光法 组织化学染色法组织化学染色法 免疫沉淀化学法免疫沉淀化学法 ELISA法法 第11页/共39页n目前目前ICA的检测方法主的检测方法主要是以猴胰腺为基质的要是以猴胰腺为基质的间接免疫荧光法，但易间接免疫荧光法，但易受组织的固定方法的影受组织的固定方法的影响。响。n抗胰岛细胞抗体与胰腺抗胰岛细胞抗体与胰腺的内分泌部位反应，可的内分泌部位反应，可见所有胰岛细胞胞浆呈见所有胰岛细胞胞浆呈现均质到颗粒型荧光。现均质到颗粒型荧光。第12页/共39页n检测方法的标化：检测方法的标化：1983年瑞典的年瑞典的Ludvigsson为一名为一名1型糖尿病型糖尿病新发病者做了血浆置换新发病者做了血浆置换,这份血浆在青少年糖尿这份血浆在青少年糖尿病基金会病基金会(FDA)组织的组织的ICAs定标实验中定标实验中,在参加在参加这项工作的所有实验室检测时均为这项工作的所有实验室检测时均为ICAs阳性阳性,于于是用这份血样定出了是用这份血样定出了ICAs的的JDF单位单位,并逐渐成并逐渐成为国际上较为通用的单位。为国际上较为通用的单位。第13页/共39页n敏感度敏感度81%(44%100%)，特异度，特异度96%(64%100%)特异度较特异度较GADA和和IA2A差差 nICA可作为早期预测指标可作为早期预测指标能早于能早于T1DM发病发病8年前被检测出年前被检测出n高滴度的高滴度的ICA（大于（大于20-40JDF单位）预示疾病进展的高危险性。单位）预示疾病进展的高危险性。n大部分大部分T1DM病人的病人的ICAs在发病在发病2年后消失，年后消失，ICA持续阳性超过持续阳性超过23年者，年者，仅占仅占T1DM的的10%。nICA滴度的持续高水平通常与滴度的持续高水平通常与细胞的损伤有关，细胞的损伤有关，ICA的水平与的水平与C肽水平肽水平呈负相关。呈负相关。nICA和其他胰岛自身抗体（如和其他胰岛自身抗体（如GAD或或IAA）同时阳性对疾病更有诊断价）同时阳性对疾病更有诊断价值，这类病人发生值，这类病人发生T1DM的危险性是仅的危险性是仅ICA阳性的病人的阳性的病人的3-5倍。倍。第14页/共39页ICA在不同人群中的阳性率在不同人群中的阳性率 ICA的检测对的检测对1型糖尿病有很好的预测价值型糖尿病有很好的预测价值 人群人群 阳性率（阳性率（%）健康对照组健康对照组 0.1-0.2T1DM患者直系亲属患者直系亲属 2-5新近诊断的新近诊断的T1DM患者患者 60-80T2DM患者患者 5-7第15页/共39页谷氨酸脱羧酶抗体谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)n谷氨酸脱羧酶谷氨酸脱羧酶氨基丁酸氨基丁酸（GABA）的合成酶）的合成酶表达于人脑及胰岛中均有，主要位于细胞浆中表达于人脑及胰岛中均有，主要位于细胞浆中具有抑制生长抑素和胰高糖素分泌的作用，并可调节胰岛具有抑制生长抑素和胰高糖素分泌的作用，并可调节胰岛素的分泌和胰岛素原的合成素的分泌和胰岛素原的合成第16页/共39页1990年，年，Beakkeskov首次证明首次证明GAD是是1型糖尿病型糖尿病的自身抗原的自身抗原GAD分子存在分子存在65kD和和67kD两种形式，两者在氨两种形式，两者在氨基酸水平上有基酸水平上有65%的同源性和的同源性和80%的相似性，免的相似性，免疫源性也基本相同，目前认为疫源性也基本相同，目前认为T1DM中抗中抗GAD65抗体更常见抗体更常见 第17页/共39页n检测方法：检测方法：免疫沉淀酶活性法免疫沉淀酶活性法 放射免疫法放射免疫法 ELISA法法 间接免疫荧光法间接免疫荧光法 化学发光法化学发光法第18页/共39页n最常用的最常用的GAD-Ab的检测方法的检测方法是是ELISA法和放免法。法和放免法。n放免法由于存在放射性污染放免法由于存在放射性污染目前已逐渐被目前已逐渐被ELISA法替代法替代nELISA法采用亲和素和生物法采用亲和素和生物素扩大级联反应增强了检测素扩大级联反应增强了检测的敏感性的敏感性第19页/共39页GAD检测方法的评价检测方法的评价nGAD 自身抗体自身抗体:41 个实验室测定了血清个实验室测定了血清GADab,其中多数运用重其中多数运用重组人组人GAD 的的RIA法法,其调整敏感性是其调整敏感性是091%(平均平均81%)。ELISA 法与法与RIAs 法比较法比较,有较好效果有较好效果,其调整敏感性其调整敏感性77%,双管测定的阳双管测定的阳性或阴性一致性为性或阴性一致性为100%。n在在125例血清例血清RIA法的阳性率为法的阳性率为22.4%，ELISA的阳性率为的阳性率为26.4%，两者的显著相关（两者的显著相关（P=0.025)。均。均 与与ICA显著相关显著相关P值分别为值分别为0和和0.01。说明说明ELISA法可以替代法可以替代RIA法做为法做为1型糖尿病自身抗体型糖尿病自身抗体筛选的有效手段。筛选的有效手段。（RIA试剂试剂欧蒙公司欧蒙公司；ELISA试剂试剂美国美国BLOMERICA 公公司）司）第20页/共39页GAD在在T1DM发病机理中的作用发病机理中的作用 n分子模拟分子模拟(molecular mimicry)机制致病学说：机制致病学说：病毒蛋白如柯萨奇病毒蛋白如柯萨奇B 病毒病毒p2C 蛋白肽段蛋白肽段,胰岛胰岛细胞细胞抗原分子谷氨酸脱羧酶抗原分子谷氨酸脱羧酶(GAD)的部分肽段序列相似的部分肽段序列相似,前者前者(外源性蛋白多肽外源性蛋白多肽)在诱导机体产生免疫的同时在诱导机体产生免疫的同时,亦可能诱发针对自身胰岛亦可能诱发针对自身胰岛细胞的攻击，导致细胞的攻击，导致细胞细胞的损伤的损伤。第21页/共39页nGAD-Ab具有与具有与细胞缓慢损伤相关性好、出现细胞缓慢损伤相关性好、出现早、持续时间长、年龄跨度大、阳性率高、检早、持续时间长、年龄跨度大、阳性率高、检测易标准化等特点，是目前公认的诊断测易标准化等特点，是目前公认的诊断LADA及及预测胰岛功能的免疫学指标预测胰岛功能的免疫学指标nGAD-Ab可于发病前可于发病前10年测出，且在此期间呈高年测出，且在此期间呈高低度持续存在，约低度持续存在，约80%新发患者血清中新发患者血清中GAD阳阳性且水平较稳定，病程性且水平较稳定，病程10年以上仍存在高滴度年以上仍存在高滴度GAD抗体抗体。GAD的临床应用的临床应用第22页/共39页nGAD抗体在大多数抗体在大多数T1DM患者中阳性，且阳性率不随病程延长而下降。患者中阳性，且阳性率不随病程延长而下降。实验显示新诊断的患儿中实验显示新诊断的患儿中GAD抗体阳性率为抗体阳性率为74%，长病程者为，长病程者为67%，而他们的而他们的ICA阳性率分别为阳性率分别为64%和和14%。n如在初发如在初发T1DM患者中查到患者中查到GAD抗体有助于排除抗体有助于排除T2DM，以助于，以助于DM诊断分型并指导治疗。诊断分型并指导治疗。n在在T1DM一级亲属（高危人群），一级亲属（高危人群），33.3%的的GADA阳性者可能患阳性者可能患TIDM。TIDM一级亲属中一级亲属中GAD抗体阳性率为抗体阳性率为15%左右，其中左右，其中1/3在在618个月个月后发展为后发展为T1DM。nGADA在僵人综合征（在僵人综合征（SMS）中的阳性率为）中的阳性率为100%,此外还见于与此外还见于与T1DM相关的多腺体自身免疫综合征。相关的多腺体自身免疫综合征。第23页/共39页GAD在不同人群中的阳性率在不同人群中的阳性率 人群 阳性率（%）健康对照组 0.3-0.6 T1DM患者直系亲属 3-4 其他的自身免疫性 内分泌疾病患者 1-2 新近诊断的T1DM患者 55-85 T2DM患者 10-15 妊娠糖尿病 10第24页/共39页抗酪氨酸磷酸酶抗体抗酪氨酸磷酸酶抗体(ICA 512/IA 2ab)nICA 512/IA 2是利用是利用1型糖尿病患者或其前期病人的血清免型糖尿病患者或其前期病人的血清免疫筛选胰岛细胞的疫筛选胰岛细胞的cDNA文库得到的一个新的文库得到的一个新的细胞自身抗细胞自身抗原。原。n其氨基酸序列与其氨基酸序列与T淋巴细胞蛋白酪氨酸磷酸酶淋巴细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)CD45相似，而碱基序列与人胰岛素瘤克隆的相似，而碱基序列与人胰岛素瘤克隆的 cDNA(IA2)相近。相近。Northern印迹示印迹示ICA 512/IA 2在胰岛、脑和垂体中均有表在胰岛、脑和垂体中均有表达。达。nRabin等发现等发现ICA512实际上是实际上是ICA的一个片段。的一个片段。第25页/共39页nIA2A存在于大约存在于大约65%（55%-75%）的新发）的新发T1DM病病人中，而正常对照人群中阳性率小于人中，而正常对照人群中阳性率小于1%。nIA-2Ab 特异性强特异性强,在不伴在不伴1型型DM的自身免疫病患者中的自身免疫病患者中较少发现。较少发现。nT1DM患者中患者中IA2A阳性率可能受多种因素影响，阳性率可能受多种因素影响，15岁岁以上以上T1DM者者IA2A阳性率最高，随增龄阳性率逐渐下阳性率最高，随增龄阳性率逐渐下降，但其发生率与降，但其发生率与DGA抗体无关。抗体无关。n携带携带IA-2抗体的个体在抗体的个体在5岁时患岁时患型糖尿病的风险是型糖尿病的风险是34岁时的岁时的11倍。倍。第26页/共39页n检测方法检测方法 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法(ELISA)放射配体分析法放射配体分析法(RLA)35S标记的放射免疫沉淀法标记的放射免疫沉淀法 第27页/共39页抗胰岛素自身抗体抗胰岛素自身抗体(IAA)nIAA的识别的抗原表位是胰岛素的识别的抗原表位是胰岛素A链的链的A8-A13残残基和基和B链的链的B1-B3残基残基nIAA与逆转录病毒的与逆转录病毒的p73蛋白间存在交叉反应，提蛋白间存在交叉反应，提示内源性的逆转录病毒感染与示内源性的逆转录病毒感染与T1DM的发生有关的发生有关nIAA与胰岛素治疗诱导的抗胰岛素抗体相似与胰岛素治疗诱导的抗胰岛素抗体相似第28页/共39页nIAA在新诊断的在新诊断的T1DM患者中的阳性率为患者中的阳性率为40%，多见，多见于儿童（于儿童（4岁），在成人中的阳性率仅为岁），在成人中的阳性率仅为4%，在，在5岁岁以前发生的以前发生的IAA阳性率达阳性率达50%，IAA滴度随增龄而降滴度随增龄而降nIAA与与ICA相关，在高危人群中约相关，在高危人群中约40%ICA阳性者阳性者IAA阳性。阳性。nIAA水平与水平与T1DM发生的速度呈相关性，高滴度发生的速度呈相关性，高滴度IAA者发病较快者发病较快第29页/共39页n检测方法检测方法 放免法；放免法；ELISA法法n不同实验室及不同方法测定不同实验室及不同方法测定IAAs,结果的一致性显著结果的一致性显著低于低于IA2A和和GADAs。第30页/共39页自身抗体对自身抗体对T1DM的诊断的诊断 敏感性和特异性敏感性和特异性自身抗体 敏感度（%）特异度(%)IAA 4070 99 GADA 7080 99 IA-2A 5070 99 ICA 84 95第31页/共39页nT1DM患者中胰岛自身抗体的阳性率常因种族、发病年龄、病程和临患者中胰岛自身抗体的阳性率常因种族、发病年龄、病程和临床亚型不同而不同。单一的自身抗体的检测缺乏最佳的敏感性和特异床亚型不同而不同。单一的自身抗体的检测缺乏最佳的敏感性和特异性，目前常采用多项自身抗体的联合检测，对性，目前常采用多项自身抗体的联合检测，对T1DM的诊断准确性更的诊断准确性更高高nIA2Ab 联合联合GADAb 及及IAA 两种以上抗体阳性具有两种以上抗体阳性具有68%的阳性预的阳性预测价值测价值,80%敏感性和敏感性和100%特异性。特异性。第32页/共39页n预测率最高的组合是预测率最高的组合是ICA加加IA-2A和（或）和（或）IA-2抗体。另一项研究抗体。另一项研究发现采用两步筛查法，即先筛查发现采用两步筛查法，即先筛查IA-2A和（或）和（或）GAD抗体，然后筛抗体，然后筛查查IAA和（或）和（或）ICA，对糖尿病的预测敏感度最高，对糖尿病的预测敏感度最高。n另有人认为另有人认为ICA的检测缺乏稳定性，通常所用的间接免疫荧光法仅的检测缺乏稳定性，通常所用的间接免疫荧光法仅能做到半定量，而推荐使用能做到半定量，而推荐使用IA22Ab 联合联合GAD2Ab 及及IAA的筛选组的筛选组合。合。n近来近来,国外还建立了一种国外还建立了一种GAD-Ab 和和IA2-Ab 一步性联合检测法。其一步性联合检测法。其结果与结果与GAD-Ab、IA2-Ab 分别检测结果高度一致。此法简单高效、分别检测结果高度一致。此法简单高效、成本低、重复性好成本低、重复性好,并可用毛细血管血作为标本并可用毛细血管血作为标本,适于在一般人群特适于在一般人群特别是少儿中进行普查。别是少儿中进行普查。第33页/共39页胰岛细胞胰岛细胞自身抗体的组合自身抗体的组合预测预测型糖尿病型糖尿病跟踪的年数糖糖尿尿病病的的发发病病率率第34页/共39页Progression to Diabetes vs Number of Autoantibodies(GAD,ICA512,Insulin)Percent not DiabeticYears of Follow-up3 Ab n=41 17 8 1 2 Abs n=44 27 15 4 2 11 Abs n=93 23 14 10 6 4Verge et al.Diabetes,1996;45;926第35页/共39页Gestational Diabetes:Risk at 2 years Type 1 Diabetes by AutoantibodiesICA,GAD65,ICA512(IA-2)Sensitivity GAD=63%;Sensitivity 3 Abs=82%Ziegler et al.Diabetes 1997:46:1459-67,N=437第36页/共39页ProgressionInsulinGADIA-2A.Ziegler第37页/共39页First antibody is insulin/proinsulin108642086420IAAIA2AGADA108642086420Age(years)Cumulative frequency(%)A.Ziegler第38页/共39页第39页/共39页