NY∕T 1466-2018 动物棘球蚴病诊断技术(农业).pdf

L一ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/ T 1466-2018 代替NY/T1466-2007 动物棘球蝴病诊断技术Diagnostic techniques for animal echinococcosis 2018-03-15发布2018-06-01实施? 中华人民共和国农业部发布NY/T 1466-2018 目次皿引言.1 l 范围.1 2 规范性引用文件3 临床诊断. .1 3. 1 流行病学.1 3. 2 临床症状13. 3 棘球蝴病病理组织学诊断.1 3.3. 1 剖检.1 3.3. 2 病理组织学变化.13. 3. 2. 1 肝细粒棘球蝴病病理变化1 3.3. 2. 2 肺细粒棘球蝴病病理变化. . . 2 3. 4 结果判定.2 4 实验室诊断.24. 1 间接红细胞凝集试验ClHA)4. 1. 1 材料.2 4. 1. 1. 1 待检血样的采集.24. 1. 1. 2 血清分离与保存.2 4. 1. 1. 3 对照阳性血清.24. 1. 1. 4 对照阴性血清24.1. 1. 5 IHA诊断液制备. . .2 4. 1. 1. 6 微量反应板.2 4.1.2 操作方法.2 4. 1. 2. 1 稀释被检血清.2 4. 1. 2. 2 加诊断液(抗原). 4. 1. 2. 3 设对照.2 4. 1. 2. 4 血凝反应. . 3 4.1.3 判定4. 1. 3. 1 判定标准.3 4. 1. 3. 2 结果判定4. 2 酶联免疫吸附试验CELISA).4.2.1 仪器.3 4. 2. 2 耗材.3 4. 2. 3 试剂4.2. 3. 1 血样的采集、血清分离与保存.34. 2. 3. 2 抗原.34.2. 3. 3 对照阳性血清.4 4. 2. 3. 4 对照阴性血清.4 NY/T 1466-2018 4. 2. 3. 5 抗免疫球蛋白-酶结合物.44.2.3.6 试验溶液. .4 4. 2. 4 操作方法44. 2. 4. 1 抗原包被.4 4. 2. 4. 2 洗涤.4 4. 2. 4. 3 封闭.4 4.2. 4. 4 加待检血清.44.2.4.5 加抗免疫球蛋白-酶结合物.4 4. 2. 4. 6 显色.4 4.2.4. 7 终止反应. . . .4 4. 2. 5 判定. 44. 2. 5.1 计算.4 4. 2. 5. 2 结果判定.4 4. 3 家畜与野生动物棘球蝴感染PCR诊断.54. 3.1 试验材料. .54. 3. 1. 1 仪器.5 4.3.1.2 试剂.4. 3. 2 操作程序. . 5 4. 3. 2.1 棘球蝴可疑包囊病灶采集 54. 3.2.2 待检样本的处理54. 3. 2. 3 基因组DNA的提取.5 4. 3. 2. 4 基因组DNA含量测定. .5 4. 3. 3 PCR操作方法. .54. 3.3.1 引物选用. . . . . . . 5 4. 3. 3. 2 反应体系 .54.3. 3. 3 PCR反应产物的观察.64. 3. 3. 4 结果判定5 诊断结果判定附录A(资料性附录)三种棘球练虫病原学与流行病学特征比较.7 附录B(资料性附录)棘球蝴包囊及囊液中原头蝴的形态学观察.8附录C(规范性附录)IHA诊断液配制方法.9 附录以规范性附录)棘球蝴囊液醋酸盐纯化抗原制备方法.11 附录E(规范性附录)抗免疫球蛋白-酶结合物的制备方法. .12 附录F(规范性附录)ELlSA榕液配制附录G(规范性附录)电泳相关试剂的配制附录H(资料性附录)基因组DNA提取方法-附录l(资料性附录)棘球综虫PCR检测方法相关信息.四附录J(规范性附录)三种棘球缘虫特异性多重PCR扩增产物电泳图.19H NY/T 1466-2018 目。吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准代替NY/T1466一2007(动物棘球蝴病诊断技术。与NY/ T 1466-2007相比，除编辑性修改外主要技术变化如下:一一修改IHA诊断方法中参考阳性血清为对照阳性血清，用棘球蝴囊液抗原免疫羊和牛制备为经病原学确诊的牛、羊棘球蝴病自然感染病例的?昆合血清制备(见4.1.1.3); -一一调整了IHA诊断方法中被检血清的阴、阳性判定标准(见4.1. 3. 2) ; 一一增加了棘球蝴巍液醋酸盐纯化抗原制备的方法(见附录0)。增加了临床症状和病理学组织诊断的内容(见3.2和3.3)。增加了三个棘球练虫虫种(细粒棘球缘虫、多房棘球缭虫和石渠棘球练虫)的PCR诊断技术(见4.3); 本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位:中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人:贾万忠、闰鸿斌、李立、委忠子、付宝权、殷宏、李有全。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:一一-NY/ T 1466-2007。mu NY/ T 1466-2018 引棘球蝴病(Echinococcosis)，又名包虫病(Hydatiddisease/ Hydatidosis) ，是由棘球属(Echi710COC-cus)缭虫的幼虫即棘球蝴(包虫)引起的一类重要人兽共患寄生虫病。因它对家畜和人的危害严重，被世界动物卫生组织(OIE)定为必须通报的动物疫病之被中国列为二类动物疫病。在中国，最常见的棘球综虫有3个种:细粒棘球综虫(E . gra71ulosus )、多房棘球缘虫(E. muLtiLoculris)、石渠棘球缘虫(E.shiquicu仆，相应的幼虫分别为细粒棘球蝴、多房棘球蝴和石渠棘球蝴，主要特征参见附录A。棘球蝴病流行于中国西部及东北广大农牧区，其中青海、新疆、宁夏、甘肃、四川、内蒙古和西藏等7省(自治区)最为严重。棘球综虫需要两个宿主(即中间宿主和终末宿主)才能完成生活史。对于中间宿主，羊是细粒棘球助的最易感动物，牛次之;田鼠是多房棘球蝴常见、易感的动物;高原鼠兔是石渠棘球蝴常见、易感的动物。对于终末宿主，犬、狐狸、狼是细粒棘球缘虫感染常见动物，狐狸和犬是多房棘球练虫感染常见动物，藏狐是石渠棘球缘虫感染常见动物。寄生部位:幼虫，即细粒棘球蛐多寄生于肝，其次为肺;多房棘球蝴多寄生于肝脏;石渠棘球蝴多寄生于肺。成虫，即棘球缘虫均寄生于犬科动物的小肠。本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及4.3.3.1引物选用相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围元任何立场。该专利持有人己向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得:专利持有人姓名:委忠子，贾万忠，闰鸿斌，李宏民，李立，范彦雷，倪兴维地址:甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。N NY/T 1466-2018 动物棘球蝴病诊断技术1 范围本标准规定了动物棘球蝴病感染的临床诊断、实验室诊断和诊断结果判定。本标准适用于家畜(牛、羊)细粒棘球蝴病血清抗体的检测和剖检及病理组织学诊断，家畜与野生动物(田鼠、瞅瞅等)刷刷晰、组恤斟病可疑包囊或病灶样品的PCR诊断，家畜与野生动物棘球蝴病流2 规范性引用文件3.1 流行病在流行食过带有棘于羊肺部时细粒棘有疼痛感，叩同部位有局限3.3. 1 剖检细粒棘球蝴寄生质性病变。寄生平整光滑、不透明。见附录多房棘球蝴多寄生于田鼠，鼠，目前，未发现寄生于家畜或人。多见图B.2。寄生大，周边有肉样实表面的包囊呈乳白色、生于高原鼠兔，也可寄生于田较大的包囊切开后，囊液略带黄色、透明，包提组织与肝、肺交界处可见乳白色包囊壁，元血管结构，囊壁分两层，其中外侧一层为角质层，内侧一层为生发层。抽取囊液，沉淀物在光学显微镜下检测，发现沉淀物中存在原头节。见罔B.3。3. 3. 2 病理组织学变化3. 3. 2. 1 肝细粒棘球蝴病病理变化显微镜下观察，羊肝细粒棘球蝴包囊外层(即外囊)呈典型的特殊肉芽肿病变，由纤维组织和上皮样细胞构成，结构致密、无血管。内囊呈乳白色、半透明、表面平滑、有光泽的球形包梨;棘球蝴囊壁分两NY/ T 1466-2018 层，外层是不含细胞结构的角质层，内层是生发层(胚层)。在生发层的内面长出很多细小颗粒状的育囊(原头蝴)及雏囊(子囊)，故名细粒棘球蝴。角质层由生发层细胞的分泌物形成，板层样结构，富含糖原，PASC periodic acid Schiff，过腆酸希夫)染色反应阳性，即红染，这是棘球蝴病的示病性特征。包主是周围肝细胞受压迫而发生萎缩;肝间质结缔组织大量增生，将肝小叶分剖，形成假小叶，小胆管显著增生。肝细胞呈明显的水泡变性，细胞肿胀。有些部位的肝细胞消失，取而代之的是一些均质、淡红染的浆液、纤维素性渗出物，渗出物中可见大量以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润、充血、出血。3.3. 2. 2 肺细粒棘球蝴病病理变化棘球蝴包囊内充满囊液，有时有原头蝴。包囊的巍壁内侧为均质红染的板层结构，板层结构外侧为普通肉芽组织;有的包囊囊壁由上皮样细胞和成纤维细胞构成，未见均质红染的板层结构CPAS阴性)。部分肺间质增生、伴随大量淋巴细胞浸润，发生炎症反应;包囊外侧肺泡腔受压迫呈裂隙状;肺泡壁高度增生，小血管充血，有大量淋巴细胞与嗜酸性粒细胞浸润。外囊壁包含肺组织和小气管。3. 4 结果判定3. 4. 1 绵羊、山羊、艳牛等出现上述临床症状，并有上述流行病学史时可判定为棘球蝴病疑似病例。3. 4. 2 在剖检或病理学检查时发现被检样本中有棘球蝴包囊、囊壁(板层结构)、PAS阳性反应、囊液或/和原头蝴，即可确诊为棘球蝴病病例。4 实验室诊断4. 1 间接红细胞凝集试验(IHA)4. 1. 1 材料4. 1. 1. 1 待检血样的采集用干燥的元菌注射器(或采血器)采血约5mL，3rC温箱倾斜放置1h，转入40C冰箱放置过夜。4. 1. 1.2 血清分离与保存从冰箱取出试管，3000r/min离心10min，用吸管小心吸出上清液，加NaN3C终浓度0.02%，/v)或硫相/l乘(终浓度O.Ol%，w/v)防腐，低温冷冻保存备用。4. 1. 1.3 对照阳性血清经病原学确诊的牛、羊棘球蝴病自然感染病例的混合血清制备，血清抗体的IHA效价为1C512 1024)。4. 1. 1. 4 对照阴性血清非感染羊、牛血清，抗体IHA效价在1: 16以下。4. 1. 1.5 lHA诊断液制备制备方法见附录C。4. 1. 1.6 微量反应板96孔Cl2X8)U型板。4.1.2 操作方法4. 1. 2. 1 稀释被检血清待检血清用pH7.2,0.15 mol/L PBS稀释液倍比稀释8个滴度1: C2256)J，每孔加样量均为25L。4.1.2.2 加诊断液(抗原)将抗原摇匀后，每孔滴加敏化红细胞25L。4. 1.2.3 设对照在每块U型板上做试验，要同时设立对照，即敏化红细胞空白对照1孔，阳性血清cl: 64)加敏化2 NY/ T 1466-2018 红细胞1孔，阴性血清(1: 8)加敏化红细胞l孔。阳性血清和阴性血清对照样的稀释与被检血清相同。4. 1.2.4 血凝反应试验微量板置振荡器上振荡1min2 min，取下，用干净的玻璃板盖住反应板，置室温(180C 250C)反应2h3 h。4. 1.3 判定4. 1.3.1 判定标准凝集程度的标准如下:a) 十十十+:红细胞100%凝集，在孔底形成均质膜样凝集，边缘整齐，致密;b) +十+.红细胞75%凝集，形成的膜均匀地分布于孔底，但不凝集的红细胞孔底中央集中成一针尖大小的圆点;c) 十+:红细胞50%凝集，在孔底形成的薄膜边缘呈锯齿状，不凝集的红细胞在孔底中央集成一圆点;d) 十:红细胞25%凝集，不凝集的红细胞在孔底中央集中成较大圆点;e) +:红细胞沉于孔底，但周围不光滑或圆点中心有空斑;f) 一:所有红细胞均不凝集，集中于孔底中央成光滑的大圆点。加抗原后所设各项对照均成立，否则应重做，正确的对照结果是:a) 抗原敏化红细胞应无自凝(-); b) 阳性血清对照应100%凝集(+十+十); c) 阴性血清对照应无凝集。4. 1.3.2 结果判定4. 1. 3. 2. 1羊对羊血清检测结果的判定标准为:a) 血凝效价二三1:64(+)判为1I日性;b) 血凝效价1: 16(+)判为阴性;c) 血凝效价介于上述两者之间判为可疑;d) 可疑者复检，仍为可疑判为阳性。4. 1. 3. 2. 2牛对牛血清检测结果的判定标准为:a) 血凝效价二三1: 32(+)判为阳性;b) 血凝效价1: 8(+)判为阴性;c) 血凝效价介于上述两者之间判为可疑;d) 可疑者复检，仍为可疑判为阳性。4.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)4.2. 1 仪器酶联免疫检测仪、单道移液器、8道或12道移液器、加样器。4. 2. 2 耗材ELISA微量反应板(96孔聚苯乙烯微量酶标板)、血清稀释板、移液器吸头等。4. 2. 3 试剂4.2.3. 1 血样的采集、血清分离与保存同4.1. 1. 1和4.1. 1. 2。4.2.3.2 抗原为醋酸盐纯化抗原，制备方法见附录D。3 NY/ T 1466一20184. 2. 3. 3 对照阳性血清同4.1. 1. 3。4.2.3.4 对照阴性血清同4.1. 1. 40 4.2.3.5 抗免疫球蛋白酶结合物兔抗或鼠抗羊IgG和牛IgG-辣根过氧化物酶结合物可从生化试剂公司购买，也可向行制备(方法见附录E)。4.2.3.6 试验溶液包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭缓冲液、抗免疫球蛋白-酶结合物稀释液、底物榕液、终止液(2mol/ L H2SO ) 。配制方法见附录F。4. 2. 4 操作方法4.2.4. 1 抗原包被用包被缓冲液将抗原稀释至工作浓度(10g/mU，按每孔100L加人酶标板。空白对照孔加100L包被缓冲液，40C过夜。4.2.4.2 洗涤弃孔内液体，用洗涤缓冲液洗酶标板3次:每次各孔加满洗涤缓冲液后停留3min，甩干。洗涤3次后，在吸水纸巾上拍干。4. 2. 4. 3 封闭每孔加封闭缓冲液100L，置37C封闭1h。弃孔内液体，用洗涤缓冲液洗酶标板3次，方法同4.2.4.2。4. 2. 4. 4 加待检血清用洗涤缓冲液将待检I但清、标准阴性血清和标准阳性血清稀释至规定工作浓度(1: 100)后各加2孔，酶结合物对照孔和空白对照孔加稀释缓冲液各l孔。加样量均为100Lo37C温育1h。弃孔内液体，用洗涤缓冲液洗酶标板3次，方法同4.2.4.2。4.2.4.5 加抗免疫球蛋白-酶结合物检测牛、绵羊血清应使用相应动物种类的抗免疫球蛋白酶结合物。用稀释缓冲液稀释至工作浓度1 : (400 1000)或按照试剂的操作说明，每孔加100Lo37C温育1h。弃孔内液体，用洗涤缓冲液洗酶标板3次，方法同4.2. 4. 2。4.2.4.6 显色加底物榕液(底物榕液可从生物化学试剂公司购买，也可自行配制，J!I夕兑L附录F盯)，每孔100L，3刀7C温育20min3Omin 4. 2. 4. 7 终止反应加50L终止液，振荡?昆匀，静置5min。用酶标仪读取每孔492nm(显色剂为OPD，邻苯二胶)或者450nm(显色剂为TMB，四甲基联苯胶)波长处的光吸收值(OD92值或OD50值)。4. 2. 5 判定4.2.5. 1 计算每份待检血清的P/N值等于每份待检血清两孔的平均OD值(P)，再除以同板标准阴性血清两孔的平均OD值(N)。4. 2. 5. 2 结果判定试验成立的条件:若酶结合物对照OD值小于0.1，标准Il日性Jm.清OD值在1.0士2SDCSD为标准误差)范围，且P/N值大于2，则试验成立。a) 凡待检血清的P/N二三2，则判定该血清为11日性;b) 如果待检血清的P/NJA GAGATGAGTGAGAAGGAGTG Egcal F CAATTTACGGTAAAGCAT caL 1001 Egcal R CCTCATCTCCACTCTCT Eg Efla F TCCTAACATGCCTTGGTAT Eg Efla R ef1 GTTACAGCCTTGATCACG 706 Ecpold F GGCCTTCATCTCCATAATA Ecpold R oLd ATGAAGAGTTTGAAACTAAAG 617 Ec NDI F CTGCAGAGGTTTGCC nad1 339 Ec NDI R CACAACAGCATAAAGCG Eg complex F TGGTCGTCTTAATCATTTG cO.22 110 Eg complex R CCACAACAATAGGCATAA 多房蚓球综虫EM -H17 GTGAGTGATTCTTG1寸AGGGGAAG12S rDNA 198 EM-H15 CCATATTACAACAATATTCCTATC F GTGAGGCGATGTGTGGTGATGGAGA U1 snRNA 332 R CAAGTGGTCAGGGGCAGTAG P60F(外)TTAAGATATATGTGGTGACAGGGA1寸AGATACCCP377R (外)AACCGAGGGTGACGGGCGGTGTGTACC 377 12S rDNA Nest F (内)ATATTTTGTAAGGTTGTTCTA 250 Nest R(内)GATAGGAATAT寸GTTGTAATATGGTATTGTEm-l(外)FTAAGATATATGTGGTACAGGATTAGATACCC 367 Em-2(外)RGGTGACGGGCGGTGTfGTA 12S rDNA Em-3(内)FATATTTTGTAAGGTTGTTCTA 242 Em-4(内)RATATTACAACAATATTCCTATC 棘球属ECHI RPB2 F rb2 TTGACCAAAGAAATCAGAC 1232 ECHI RPB2 R CGCAAATACTCCATGG 注:资料来源于(OIE陆生动物诊断试验与疫苗手册(2017年)中参考引物。18 NY/T 1466-2018 附录J(规范性附录)三种棘球缘虫特异性多重PCR扩增产物电泳图三种棘球综虫特异性多重PCR扩增产物电泳图见图.1。M 2 3 4 bp 2000 1000 删25m0 f=3C司飞?勺司:=33飞仓们21叩9 E J 100 说明:M一-ONA分子标准OL2000，从大到小依次为2000bp、1000bp、750bp(最亮)、500bp、200bp和100bp; l一一三种棘球缘虫混合引物扩增细粒棘球练虫基因组ONA模板时的多重PCR结果，2一一三种棘球缘虫混合引物扩增多房棘球缘虫基因组ONA模板时的多重PCR结果;3 三种棘球缘虫混合引物扩增石渠棘球综虫基因组ONA模饭时的多重PCR结果;4 三种棘球综虫混合引物扩增时的阴性对照。图J.l三种棘球缘虫特异性多重PCR扩增产物电泳图19 goN|寸?同FZ中华人民共和国农业行业标准动物棘球蝴病诊断技术NY/ T 1466-2018 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码:100125网址:) 中罔农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销长* 兴争等印张1.75 字数35千字2018年5月北京第1次印刷关2018年5月第1版书号16109 4500 定价44.00元争夺开本880mmX1230mm 1/16 版权专有侵权必究举报电话[phone] NY /T 1466-2018