NY∕T 3081-2017 番茄抗番茄黄化曲叶病毒鉴定技术规程(农业).pdf

ICS 65.020 16 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3081-2017 番茄抗番茄黄化曲叶病毒鉴定技术规程Rule for evaluation of tomato resistance to tomato yellolV leaf curl virus 2017 -06-12发布2017 -10-01实施气;、中华人民共和国农业部发布前本标准按照G!T1. 1二2009给出的规则起草。本标准由农业部种植业笆理司提出。本标准由全国蔬菜标准化技术委员会CSAC/TC467)归口。本标准起草单位。中国农业科学院蔬菜花卉研究所。本标准主要起草人。谢丙炎、冯兰香、杨字红、茹振)1 1、陈国华、凌挝、杨翠荣。NY! T 3081-2017 l NY/ T 3081-2017 番茄抗番茄黄化曲叶病毒鉴定技术规程范围本标/11规定了番茄抗番茄1ft化rll111-病毒(/OI1/0!OyelLow leaf curL viru . .;)的鉴定方法和评价方法。本标叫i适用于所有番茄(SoLal/l川Ly户U川cumL)品种及材料抗番77i1黄化1111叶病毒的室内鉴定及抗性评价。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改-y1)适用于本文件。G/ T 6682 分析实验室用水规格5fn试验方法3 术语和定义NY/ T 1858.7界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 番茄黄化曲叶病毒IOmaW yellow leal cllrl lirllS, TYLCV 属 于双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花il-r病毒1m.(BegoJllvirus)病苟-粒体为双联体结构，向两个不完整的二十面体组成，无包膜。是一种通过炯粉虱和l嫁接传播，可严重危害多种双子il十植物的童安病毒。3.2 番茄黄化曲叶病(oma(o yellow leaf ClIrI disease, TYLCD 111番茄i黄化II11叶病毒引起的番茄i病毒病害。病在i金IfJr参见附录/，注1束?可窑的主要症状是病时明血变小、皱销.Ilit问变筑、111缘鲜政.111片卷1111呈杯状或f，l状，m株严巫矮化顶部形似菜花状。4 试if1J与材料除|非另有说明，本方法所用试开IJ均为分析纯，水为GB/T6682中规定的三级7J(，4.1 MS培养基4. 1. 1 MS液体培养基称取MS干粉u飞1519)4.13g泊湖!f30g，1J11水定容至1000mL.搅拌均匀并济化后.调节pl-I:如5. 8! 于121(高压灭茵30min，4(下似有一备j抖。4. 1. 2 MS固体培养基称且MS干粉(M519)4.43 g、煎:jj!f30 g、JJ.脂粉9g.1m水定容至1000mL，搅拌均匀fj游化后，调节pJ-l为5.8，干121(高压灭菌30min，4(下保存备用。4.2 YEP培养基4.2. 1 YEP 液体培养基称且1民蛋白j陈10g、酵母提取物lOg、1化1115 g. 1111水950mL，)刊5moll L氢氧化例熔l调节pH为7.0定容至1000mL，于121(高JT.灭j!f30 min，4C下保存备J+J。4.2.2 YEP固体培养基NY /1 3081-2017 称取)J9蛋白)陈10g、酵l过提取物10g、氯化创5g、脂粉9g，!m水950mL，用5mol/ L氢氧化制济液调节pH为7.0定容至100001L.于121C高压灭菌30min . 4 C下保存备用。4. 3 抗生素母液4. 3. 1 卡那霉素母液(50mg/mL) 称取250mg卡那篇素.溶人5O1L 7)(中后，在超净台内注入501L的一次性注射然中，经硝酸纤纬索)J草(于L径。.2201)过Jf灭菌.JJ得50mg/01L卡那每京:每液。分装到5个灭菌的2mL冷冻管里，每笆101L，直2C8C冰箱中保存，可使用1个月;或20C长期保存。4.3.2 利福平母液(50mg/mL) 称收250mg利很平于EP但净台内注入501L的一桶平l寻液。分装到514.3.3 Zl!i先丁香丽母事-F取98.1 O1g j台内注入501L乙5 5. 1高灭菌凰加热器。5.2 超净工洁净等级0.25 m/ sO 5. 3 恒温培养箱括:泪范围，5C5. 4 植物生长箱温度范围，OC50C170卢刚/(m.s)两阳光!R;5. 5 超低温冰箱7昆控范围-60C一105C ，功率1200W，除声63d, 5. 6 恒温摇床，再加水定容至5mL，然后在超口除菌，即配成5001g/01L和l个月。501L，然后在MJZ 100 010101/ L l:Ff.fl 1个月。法电) ，平均风速.。mol/(m2.s)时控制或连续运行。回旋频率?I应用30r/ min600 r/ O1in，回旋频率精度:I:lr/min;摇板摆振幅度26mm;且控范围，5C60C，温度均匀皮:1:0.5C;环境混度要求，5C30C。5. 7 冷冻台式离心机最大容ii):，6mLX85 mL，最高转速30000r/ min，最低转速100r/01in，且皮范围20C40C。5. 8 可见分光光度计l!d王范围200nm 1 000 nm, i1!i:主精度:1:1.0 III币。2 NY/ T 3081-2017 6 对照晶种与种子消毒6. 1 对照品种以Money-maker或中蔬6号等易感病的番五ii品种，作为感病对J!H品种。6. 2 种子消毒所有番茄品种和材料的种子经灭茵水浸泡12 h后，再依次经70%乙醉表面消毒30s、20%次氯酸纳浴液(含0.1%1吐温-20)浸泡15min.最后用灭菌水冲击:5次6次，1111芽播种。7 烟粉虱接种鉴定7.1 适用范围烟粉虱接种鉴定比注本方法较易受到判为抗病。72 人工病固建在防由加1毒烟和虱带毒烟粉虱株幼苗。定期间不得施用7.5 病情调查7. 5. 2 病情级别划分接种植株的病情级别内。育到感病数值后.p 表1番茄抗番茄黄化幽叶病毒烟粉虱接种鉴定的病情级别划分病如!级别症状描述O 无可见症状顶端叶片的边缘轻蚀黄化或卷Ilh2 少数叶片的边缘或1Ii问轻度黄化、部分病叶轻做卷1111，顶端叶片变小3 多数叶片的边缘或脉间重度放化、叶缘上翘病叫卷1111、顶端叶片显若变小，植株轻!主矮化4 ?在株叶片严京变小、1JJ.化、上翘、卷1111节问捕短，植株蓝度矮化，甚至停止生长7. 5. 3 调查方法3 NY/T 3081-2017 根据接种植株的病情级别及其相对应的症状tlW述，调查所有接种植株的发病情况d己载每lfl株的病ItI级)11.;)1一计算每份鉴定材料的病i附指数(01)， 3次重复病情指数的平均值。病情指数(o)按式(1)计算.式中。0/ 病情指数，各病情级别的代表数值，了(sX 11) 0/=土兰一一一 X100 ,. (l) NXS 11 各病情级别的植株数，单位为株，N 调查总植株数，单位为株;5 最高病Iei级别的代表数值。7. 6 抗病性评价7.6. 1 评价标;佳依据待鉴定番茄3次重复的病情指数平均值确定其抗性水平礼1I:51-标准I;表2。表2番茄对番茄黄化曲叶病毒抗性的评价标准病占指数(o/)抗病怕评价。;0/15t1f( Highly rcsistant( I-IR) 15() 1 30 打UI市Re:o;i!wnt(R)30/)155 中抗Moderatelyresisli1nt(MR) 550177 E虫病Sm;ciptiblc(S)77:三011001 !:吕J-lighlysusc巳pribleCI-IS) 7. 6. 2 鉴定有效性判别当!惑病对!哥材料达到其中J!I感病程度(0/二三55)，该批次鉴定视为有效。7. 6. 3 鉴定材料处理鉴定完毕后，1自fYj杀灭室内烟粉虱，并将人工病刷1所有的番mtil株及残体进行无害化处理。7.6.4 鉴定记载表格番茄l抗番茄黄化rll1叶病毒鉴定结果记载表格参见表C.LB iE室僵染性克隆农杆菌接种鉴定8.1 适用范围本方法无街饲养烟粉虱，其操作简便、快速、1ft确，适用于具有番茄i黄化rth叶病毒呈染性克隆农杆茵茵株的单位大规棋鉴定o8. 2 接种毒源接种毒源为番茄黄化IIIWI病蒜侵染性克|坠农杆茵茵株，可参J!lB. 2的方法自行制备，也可从相关单位引进。8. 3 制备农杆菌接种体将冻存的番茄1黄化1111nl病毒侵染性克陈农杆茵茵株按中l至含卡刀jC再素100mg/ L和l利福平50 mg/ LJ(j YEP 团体店养基上，划线j种或均匀涂板(28士1)C11i养24 h48 h，菌落l主好或民满培养JlIl后用作按种体。8. 4 牙签刺伤接种当衍鉴定的番jHif;1茵i王至4片5片真111时，)干l牙签挑取培养好的|刮体平板iY在.在距离幼苗根部 cm-2 cm处Jl!IJ1MIJ茎!现皮lijl，共和I 3处。ill伤接和l后的番茄植树fi:于|坊虫塑料仰l或|坊虫jt室里 进行正常的)1巴水笆理。8. 5 病情调查8.5. 1 调查时间NY / 1 3081-2017 接种14d16drr;观察鉴定书l(株的发病症状.42d44d后统i十发病忻况.病情指数达到!这病数值后，11x川有待鉴定番茄植tli进行病情调查。8. 5. 2 病情级别划分同7.5.208. 5. 3 调查方法|司7.5.3。8. 6 抗病性评价同7.609 试管苗侵染性克隆农杆菌接种鉴定9.1 适用范围l1筒在I交染性克|雀农HlH主和l鉴定的全部操作古1局限在很小的封闭环境1.适用于番茄抗番茄黄化1111nl病毒危险性株系的接种鉴定。i圭本方法能有效地避免危险性1i.jI.1i，&I1:;1j;刷粉虱向纠知扩散.)j不受任何外抖闪东干扰.ff其实地反映，11衍主植物J主事1-11)(几乎l病liJ司所JI友的症状。9. 2 培育试管苗在j白净工作fT内将j鉴定的il红番Jji1l 子插丰|呐4灭菌的陪养1111内.进恒ilNl箱内1!ii芽L黑11击.(25土1f C . 冉在超净工作行内将发芽的番五l1l 子转捅干装有MSI百|体l点养基的主l古瓶内最后放在光)(-1培养箱内光1m16 h/黑暗81丁，(25:1:1 )OCit;养21d25 d备川。9. 3 接种毒源118. 20 9. 4 市IJ备农杆菌接种液将i为:存的番五illE化IIIJllr病萄佼染性克隆农杆菌菌株在YEP11体情养基(含卡那霉素100mg/ L、利而平50mg/U土戈1线.经恒市iLt百1，24 h48 h后(28土I)OC，挑取单个lli落于50O1L YEP液体l!f养基(含卡那1i;-;素100mg/ 1.、利机平50mg/ 1.)中，(28土j)C、200r/ mil1振荡Ii1养过夜，RI得番刀11jl化1/1111一病毒佼染性克险农杆闹的凶恶液。再将菌旦、浓于4C下，4000r/min离心10rnin.随口1月JMS液体培养基(含乙lliI丁吞酣100mol/1.)悬浮沉淀，在可，r.)(;光度计60011m处测定农中|茵茵岩、Ijfl(J浓度，将浓度调至00，忡。=0.5作为接事1 1位.jt:40(备用，2d内JJJ完。9. 5 微型枝浸润接种从番茄iHtfi苗上切Wz圭2.0 cm2. 5 cm的微型枝.将微型枝;Jrl;部在农iT药接种l.，浸润mn放在灭茵l吸水纸上l吸干残余菌液，jljfj UI转移到装有MSii体均养3点含乙lliI丁吞目ilOOmol/U的Jg养1111.中，(28土J)C黑II;?(共培养48h;然后J II灭囱7(1;头也l庭的500mg/U连续淋洗i世型枝基部3次4次再经I吸干后移入装有上述MS固体lf;:养基的大试笆 1(20mmX 150 mm或25mm X 200 ITIm句一试装有1/4高度的脑养主lli).每132移入一个微型校;3次茧复每一重复15个微型校.所有试管世ift于植物生长箱中继续Jj养.(25土1) C、光!m16 h/黑暗8ho 9. 6 病情调查9.6.1 调查时间微型校接和后21d23 d观级鉴定植栋的发病症状.42【144d统d发病悄况、l-!J丰病ltj指数和评价鉴定材料对番茄黄化1!ll日十病毒的抗性。3 NY/ T 3081-2017 9 6. 2 病情级别划分接种植株的病f级别及其相对应的症状扣III述见表30病忖f级别。? 3 4 963 调查方法同7.5.309. 7 抗病性评价lfil 7. 60 6 表3番茄抗番茄黄化曲时病毒微型校接种鉴定的病情级别划分症状描述无见症状顶端叶片边缘轻微放化羽状复叶的小叶末瑞i前化平;1轻微卷1111多数1叶片黄化、边缘上翘卷1111.顶端111片显著变小.tii眯矮化整株叫j中严重变小E若11化、上翘、卷1111植株严亚矮化或丛缩A1 学名和理化特性A. 1. 1 学名附录A(资料性附录)番茄黄化曲叶病的主要病毒病原NY/T 3081-2017 番茄l黄化1111叶病的主要病毒病原为番茄茧化1111叶病毒(lomatyeLlowL归e时/c川J川u川，.TYLCV川), 属于双生病丑毒L科CGemin川nl川1川川飞V川F病萄oA. 1.2 形态描述番茄黄化IIIWI病毒具有典型的双生病毒孪生颗粒形态.病毒粒体的大小约为20nmX (2830)nm， 无包膜(见图A.lJ。A. 1.3 理化特性图A.l番茄黄化曲日十病毒粒子的电镜照片, I -I Czosne、kct al. . 1997) TYLCV为单组分双生病毒，病萄;J!iIl;fi担DNA仅含有一条2.7k b的环状lyl链DNA分子，病711基因组DNA包裹在孪生粒体1*10TYLCV DNA含有6个ORFs在二病lHjj:上编码Vl和V2;在互补链上编码Cl、c3和lC斗。Vl编码病毒外壳蛋l气，与病萄粒子的包装、介体传奇、系统侵染及与寄主的互作相关;V2编码的蛋臼与病毒的运动相关并且是基因沉默拥J11子。Cl编码复制相关蛋白，参与病毒链DNA的复制l起始.编码转录激活蛋白，训节病毒链上各个基囚的转录;C3编码复制增强蛋白，辅助Cl增强病毒的复制效率，嵌合于Cl、编码的蛋白，被认为与症状jt;)戎相关。A2 病毒株系分化根据TYLCV核背酸序列的同源性和地理分布将其分为3个群体.地j海东部群体，ti!l1 i每四翻q阵体和l泰国群体。地1海东部群体主要有以色列分离物、埃及分离物、黎巴嫩分离物、约旦分离物、塞浦路斯分离物等.这个m体叶病毒序列的同源性高达96%;地中海四部群体主要有意大利西西里分离物、兹大利撒丁岛分离物、四日f牙木尔西亚分离物、西班牙阿尔美里Ji.分离物等，其病毒序列同源性分另1达到了89%99%;泰同群体为双组分的TYLCV.主要有泰国消迈分离物、泰同Jiiii开府分离物和泰国色军分离物。目前，已知的大多数地区和国家的TYI.CV分离物均与来自以色列和意大利撒丁岛的分离物NY/ T 3081-2017 来缘关系较近，或者是这两种分离物的变异。l徐丁YLCV外.引起我国番茄黄化11I1I1j苟的病毒还有q-q叫番茄黄化1111111病lr;(Toma(yellw/jcur/ Chilla virus . TYLCCNV)、巾|司需木瓜1II1I1i病毒(Paaya/eaJ ClIrL Chillvirlls. PaLCuCNV)、台湾桥茄rlllll病丑j;(丁川110leaf cl.lrl Tai乱11virlls. TLCTWV)和泰同番茄l世11111叶病毒(T，111fye/川lef【 IIrl丁hi/，/ virlls, TYLCTI-IV)f,$. 8 NY/T 3081-2017 附录B(资料性附录)番茄黄化曲目十病毒侵染性克隆的农杆茵茵株8.1 农杆菌介导的番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆的含番茄黄化rth叶病毒TYLCVl基1151红lDlA的植物表达载体、并对番)Jftll.t生具有高效佼染能力的农朽liTI自株.经体外佼染寄主细胞后能导致番Eii寄主植物发生TYLCV病富的症状。8.2 番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆农杆茵茵株的获得j;lY 1哥王ilfit化山l叶病毒样本基因当l总DNA，;fIJJtJ该病蒜的特异性引物和IPCR检测方法.扩:tf:出病，1N.1到组的全序列后.将扩价产物克降至T-Vector 1- . ;11对克隆产物进行PCR筛选和l序列ijYJ定;再利川限制性两切的方法把病ftl凶组全伏的1.2个2个重复序列构建到改良型创物表达载体上，获得干ii有l玄病毒的佼染性克|堡，最后通过常规的=来交配:1吁其侵染性，克|坠导人农杆茵茵眯的细胞1-0 9 NY/ T 3081-2017 附录C(资料性附录)鉴定结果记载于昏Bil抗番茄贫化1 111叶病毒的鉴定结果记载表儿表c.1.表C.l番茄抗番茄黄化曲时病毒鉴定结果记载表需Bi1名称来源U 病扣1级别(株数)到可怕平均编号区号。级l级2级3级4级指数病指l n 111 l鉴定地点2播种CI)自l3.也利，方法4. I真种日WI5训班人员6. ，I主HIWI在定技术负货人(签字)10 抗病性评价hFON|0的阳、讪Z中华 人民共和国农业行业标准番茄抗番茄黄化幽叶病毒鉴定技术规程NY/ T 3081-2017 . , 中国:(. l :1:版社出版(北京市阴阳区麦子店街18号梭)( 11111政编码100125 网.iJ1:WVV. cca pm. cn) 中 国农业:1版丰l印刷厂印刷新华书店北京友行所发行各地新华书店经时j* 峰拭71丰880mmXJ230mm 1/ 16 ;P;JIE 1 数20千字2017 F 9月第l版2017年9月It京第l次印刷I号16109 281 定价25.00元4哈书哈版权专乎可侵权必究举报电话[phone]