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食堂安全检测方案

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2020年4月19日
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南京晓庄学院食堂菜品及检测方案
张红琳 王蓉蓉
南京晓庄学院食品科学学院
一、 检测目的
食堂菜品及餐具检测的目的是保证是其安全，并确保全校师生吃上安全可口的饭菜，预防食品中毒事件发生！
二、 检测对象
南京晓庄学院南、北两个食堂的菜品及餐具 。
三、 检测团队
南京晓庄学院食堂安全检测小团队 （由食品科学学院食品科学专业的大四、三、二、一年级的学生组成，指导教师 张红琳 王蓉蓉 ）定期对食堂菜品及餐具进行检测。
为保证检测工作下去 ，每年招新，从我院学生中选拔优秀的学生进入团队 。
当前团队分工如下：
人员安排：鲍春根负责微生物方面实验，小组成员黄俊楠、刘甜甜、徐福飞
覃洁琪负责食品农药残留，小组成员冯翔宇、郑颖、甘可凡
吴颖锋负责重金属检测，小组成员吴子凡、庄宁、付雨雨
四、 检测内容
1、微生物的检测
食品微生物污染是食品腐败变质，引起食物中毒的主要原因，因此是我们检测工作的重点 。我们主要对餐具与菜品（熟食）进行检测。
1.1 餐具检测
餐具清洁与否，影响者食品安全。
为了检测餐具是否消毒彻底，我们选用大肠杆菌检测试纸片来检验其是否超标，如超标说明消毒不彻底 。
1.2菜品微生物检验
中国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数，大肠菌群和致病菌三项。
1.2.1菌落总数的测定
我们采用国家标准介绍的方法检验菜品中的大肠杆菌 ，所得结果参照国家标准判定是否超标。
采用平板菌落计数法：
以无菌操作将检样25g剪碎，放于含有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶中，经充分震荡制成1:10的均匀稀释液。用1mL灭菌吸管取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的灭菌试管中，震荡摇匀制成1:100的稀释液。依次类推，做出一个梯度的稀释液。选择2~3个适宜稀释度，移取1mL稀释于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
移入平皿后及时将凉至46℃的营养琼脂培养基注入灭菌平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基注入空白灭菌平皿中做空白对照。待琼脂凝固后翻转平板置于36℃恒温箱中培养48h，取出计算平板内菌落总数数目，乘以稀释倍数，即得每毫升样品中菌落总数。根据GB 4789- 普通食品中菌落含量不能超过3000cfu/g(ml)。
实验材料：
营养琼脂培养基的制备：称取2.5g琼脂粉，9g蛋白胨粉，一起放在烧杯中溶解，移至容量瓶定容至250ml。摇匀后，移至250ml锥形瓶中，用报纸封好。
无菌生理盐水的制备：称取2.25g氯化钠固体，溶解定容至250ml容量瓶中。摇匀后，移取9ml至25ml锥形瓶中，报纸封好。另取225ml至250ml锥形瓶中，用报纸封好。
实验仪器：无菌操净台和恒温培养箱
1.2.2、大肠菌落的检测
采用快速试纸片法
样品制备：以无菌操作将检样25g剪碎，放于含有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶中，经充分震荡制成1:10的均匀稀释液。再制作一个1:100的均匀稀释液。一般饮料和饮用水采用原液和1:10两个稀释度，其它食品采用1:10和1:100两个稀释度。
检测：快速检验纸片每份由3片大纸片和6片小纸片组成，用10mL灭菌吸管吸取10ML原液或者第一稀释度的稀释液加入含有大纸片的塑料带中，吸透后平放做三个重复；然后再用1ml灭菌吸管吸取1ml同一稀释度的稀释液涂布到含有小纸片的塑料袋中，做3个重复；然后再取一支1ml灭菌吸管吸取1ml第二个稀释度的稀释液涂布到含有小纸片的塑料袋中，做三个重复。
结果判定：将接种好的纸片放入37℃培养箱培养15~24h，若纸片变黄或者在黄色背景上呈现红色斑点为大肠杆菌阳性纸片，纸片保持紫蓝色不变或在紫蓝色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄色则均为大肠菌落阴性纸片，记录每个稀释度大肠菌落阳性纸片数，根据大肠杆菌MPN表查出相应的大肠菌落数。（原液的菌落数在查出的结果数除以10）
实验材料：试管，采样瓶，试纸片
实验仪器：无菌操净台，恒温培养箱。
1.2.3、常见致病菌的检验（以沙门氏菌为例）
采用快速试纸片法：
沙门氏菌的检验（沙门氏菌测试纸片法）：以无菌操作将检样25g剪碎，放于含有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶中，经充分震荡制成1:10的均匀稀释液。将测试片水平放在台面上，揭开上盖膜，用灭菌吸管吸取稀释液0.5ml，均匀加到吸水滤纸上，然后轻轻将盖膜放下。将加了样的测试片平放在37℃培养箱内培养15~24h。对测试纸进行观察，呈紫红色的菌落为沙门氏菌。
1.2.4 季节性致病菌检测
食源性疾病多发生在夏秋季节，在这两个季节增加菌痢、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的检测。
1.3 菜品中农药的检测
主要检测食堂里的原材料如大米、蔬菜等的检测。
采用快速试剂盒检测：
1.3.1 准备工作
.农残缓冲试剂+500ML试剂瓶（一袋）+少量蒸馏水，摇匀 +蒸馏水至500ML刻度线，摇匀备用（可在室温中存放）
显色剂滴瓶中+5ML农残缓冲液 + 摇匀备用
底物滴瓶中+5ML蒸馏水/纯净水（摇匀） 0-4摄氏度冷藏备用
酶试剂瓶中的酶转移酶试剂专用瓶中
1.3.2 取样工作
A 、称取2g菜样：①垫纸②剪取③将样品剪为长宽约1CM小块
B、放入样品提取瓶中
C、加入8ML农残缓冲液震荡提取，静置两分钟

1.3.3样品检测
根据试剂盒操作说明认真操作，进行检测工作
抑制率(%)= [ (∆ A0 - ∆ At ) / ∆ A0 ] × 100
式中： ∆ A0 ——对照溶液反应3min吸光度的变化值；
∆ At ——样品溶液反应3min吸光度的变化值。
1.3.4 结果判定
结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。

当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时，表示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在，样品为阳性结果。阳性结果的样品需要重复检验2次以上。
酶抑制率法对部分农药的检出限
农药名称
检出限/（mg/kg）
农药名称
检出限/（mg/kg）
敌敌畏
0.1
氧化乐果
0.8
对硫辛
1.0
甲基异柳磷
5.0
硫磷磷
0.3
灭多威
0.1
甲胺磷
2.0
丁硫克百威
0.05
马拉硫磷
4.0
敌百虫
0.2
乐果
3.0
呋喃丹
0.05
符合率：在检出的抑制率≥50%的30份以上样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。
1.4 大米中重金属Cu、Pb、Cd含量的快速检测
传统的检测技术在应对频发的食品安全问题时愈发凸显其繁琐、耗时、不易现场操作的一些缺陷。而ELISA试剂盒作为一种快速、可靠的检测方法，其应用解决了传统检测的一些缺陷。
因此，在检测我校食堂大米中的重金属含量时，采用ELISA试剂盒来检测。
实验内容：
1.4.1 样品及其制备
将从食堂采集的大米样品直接干磨至粉末状，储存于密封盒内常温下保存备用。
1.4.2 样品的前处理
用电子天平称取大米样品1份，2.000左右，至于10ml离心管中，加入4.0mL的2M的稀HCl，置漩涡混合器上振荡30s于25℃下反应20min，4000rpm下离心15min，取上清液于2ml离心管中，13000rpm下离心10min，取上清液2ml。
1.4.3 ELISA测定样品的方法
用少量4.0 M Na OH溶液调整样品的p H值，加入螯合剂后，进行如下操作：
1) 将将系列浓度梯度的标准品和预处理样品分别加入到已经包被有检测抗原的板孔中（50 μL/孔），并标记。每标准品浓度设三孔平行，样品设四孔平行。
2) 加入抗体工作液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，加盖板膜后置于37℃避光环境中，反应30 min。
3) 洗板，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300 μL /孔充分洗涤4~5次，每次间隔3 min，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破）。
4) 加酶标二抗100 μL/孔，轻轻振荡混匀，加盖板膜后置37℃避光环境中反应30 min后，洗板。
5) 显色，依次加入TMB底物A液与底物B液各50 μL于微孔中，振荡混匀。室温避光环境中反应10 min。
6) 测定，每孔中加入50 μL终止液（2.0 M 硫酸溶液），轻轻振荡混匀，用酶标仪于450 nm 处测定每孔OD 值。
7) 按公式（1）计算重金属离子对抗体的抑制率I以重金属浓度对数为横轴，抑制率为纵轴，绘制重金属浓度抑制率标准曲线，依此曲线计算样品中重金属的浓度。
根据GB 2715-  粮食卫生标准规定铅不超过0.2mg/kg、镉不超过0.2mg/kg、汞不超过0.02mg/kg、砷不超过0.15mg/kg
实验仪器与设备
电子天平、高速离心机、电热恒温水浴锅、漩涡混合器、酶标仪、超纯水、5ml、100~1000μl移液枪
实验试剂
铜标准溶液、镉标准溶液、铅标准溶液、浓盐酸、磷酸二氢铵、氢氧化钠、四甲基联苯胺TMB、羊抗鼠IgG-HRP、磷酸缓冲液（PBS）
五、 检测频率
对于微生物检测一周检测一次
农药检测，两周一次
重金属检测 ：大米进食堂后抽检
检测人员佩戴工作证，由学生联合会志愿服务中心权益服务部监督进入食堂后场，微生物样品包含原产品、半成品、成品以及餐具，农药残留样品主要包括果蔬原产品，重金属检测主要包含大米等。
六、 检测费用
主要是材料费用及试剂盒，大约需要2万元。
同时，我们为了保证能快速检测出食堂里的微生物，我们还在进行快速检测试剂盒的研究。