附子配伍对正常小鼠心电图.doc

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瓜蒌、附子配伍对正常小鼠心电图、心肌MDA的影响

吴舟峰 张圣璎 龚帆 姚琼 周清
指导老师：张伟荣
上海中医药大学2005级中医临床七年制，201203

[摘要] 目的：观察十八反中瓜蒌、附子配伍使用对正常小鼠心电变化、心肌组织MDA的影响，探讨两者合用对心脏功能是否产生或增强毒性作用，为临床安全有效使用提供实验依据。方法：选用昆明种清洁级小鼠100只，体重18-22g，雌雄各半，随机分成10组，每组10只。取140g附子，140g瓜蒌，60g附子，加适量水浸泡半小时，附子单煎连续煮沸2小时，瓜蒌煮沸半小时，60g附子先煮沸90分钟，再加入80g瓜蒌煮沸半小时。煎煮完，最终浓缩或稀释成含生药0.25g/ml的药液。按照分组给药：空白组饮用水0.2ml、小剂量附子组0.39g/kg、小剂量瓜蒌组0.52g/kg、小剂量附子瓜蒌组0.91g/kg、常规附子组1.17g/kg、常规瓜蒌组1.56g/kg、常规附蒌组2.73g/kg、大剂量附子组3.51g/kg、大剂量瓜蒌组4.68g/kg、大剂量附蒌组8.91g/kg，各药物组剂量为70kg成人单位体重用量的9.1倍。药物灌胃每天1次，连续7天后，进行麻醉心电图测定，I、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF导联的心电图进行分析，处死小鼠取出心脏，测定心肌组织丙二醛（MDA）含量。结果：从各组心电变化与心肌组织丙二醛（MDA）的含量的比较，小剂量（附子3g、瓜蒌4g）、常规用量（附子9g、瓜蒌12g）、大剂量（附子27g、瓜蒌36g）三个剂量水平，同一比例（附子：瓜蒌=3：4），附蒌合用组与单味组之间没有明显差异（P>0.05）。我们初步认为本实验中的附子、瓜蒌合用并没有产生心脏毒性，从小鼠心脏功能方面来说，附蒌合用不存在相反作用。
[关键词] 瓜蒌；附子；小鼠；心电图；丙二醛（MDA）

瓜蒌反附子为中药“十八反”配伍禁忌，笔者通过查阅文献资料发现，临床上同用瓜蒌与附子的实例屡见不鲜，并取得了良好的治疗效果，并未出现不良反应。
瓜蒌与附子合用是否产生或者增强毒性呢?两者同为临床治疗心脏疾病的常用药，故本实验就选取心电图和心肌丙二醛（MDA）为观测指标，探讨两者配伍对正常小鼠心脏功能的影响。
1．材料与方法
1．1实验动物
健康昆明种清洁级小鼠100 只，体重18-22g，雌雄各半，上海中医药大学动物实验中心提供。
1．2药物
清炒瓜蒌皮、清炒瓜蒌子，购自上海康桥中药饮片有限公司，产地山东；熟附片，购自上海康桥中药饮片有限公司，产地四川；瓜蒌由瓜蒌子与瓜蒌皮以2：1剂量比组成。
各药物组：小剂量附子组（3g）、小剂量瓜蒌组（4g）、小剂量附蒌组（附子3g、瓜蒌4g）、常规附子组（9g）、常规瓜蒌组（12g）、常规附蒌组（附子9g、瓜蒌12g）、大剂量附子组（附子27g）、大剂量瓜蒌组（36g）、大剂量附蒌组（附子27g、瓜蒌36g）。
140g附子，140g瓜蒌，60g附子，分别放入三个不锈钢锅，加适量水浸泡半小时，附子单煎连续煮沸2小时，瓜蒌煮沸半小时，60g附子先煮沸90分钟，再加入80g瓜蒌煮沸半小时[1]。煎煮完，水浴浓缩或者加开水稀释成含生药0.25g/ml的药液，冷却后放入冰箱4℃冷藏，备用。
1．3主要仪器与试剂
1．3．1心电图
心电图机，型号ECG6511，上海光电医用电子仪器有限公司生产；4.5号注射器针头作为电极； 1%戊巴比妥钠溶液作麻醉剂。
1．3．2心肌丙二醛（MDA）与考马斯亮蓝蛋白测定
丙二醛测定试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所生产。
匀浆机，漩涡混匀器，恒温水浴箱；DL-50RC低温离心机，上海中科生物医学高科技开发有限公司生产；UV-2100型分光光度仪，尤尼柯仪器有限公司生产。
1．4实验方法
1．4．1分组与给药
健康昆明种小鼠100 只，体重18-22g，雌雄各半，常规饲养一周后，随机分为10组，每组10只。各组给药方法如下：空白组饮用水0.2ml、小剂量附子组0.39g/kg、小剂量瓜蒌组0.52g/kg、小剂量附蒌组0.91g/kg、常规附子组1.17g/kg、常规瓜蒌组1.56g/kg、常规附蒌组2.73g/kg、大剂量附子组3.51g/kg、大剂量瓜蒌组4.68g/kg、大剂量附蒌组8.19g/kg，各药物组剂量为70kg成人单位体重用量的9.1倍。
各组小鼠药物灌胃，每日1次，连续7天，期间小鼠常规喂养。灌胃后，观察小鼠反应症状，毛色，死亡情况等。
1．4．2心电图测定[2]
各组小鼠连续7天灌胃以后，第8天进行心电图测定。
选择安静整洁的实验室，打开心电图机，预热5分钟，调好基线，稳定后待用。
将各组小鼠依次用1％戊巴比妥钠按体重10mg/g（根据预实验得到），腹腔注射麻醉。
待小鼠入睡后，取仰卧位，过15分钟后测心电图。心电图机纸速为50mm/s即每小格代表0.02s，定准电压为1mV=10mm，每小格（1mm）为0.1mV。
电极连线分红色(右上肢)、黄色（左上肢）、黑色（右下肢）、绿色（左下肢），将注射器针头电极对应刺入四肢皮下，描记I、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF导联的心电图。
1．4．3心肌丙二醛（MDA）测定
待小鼠测完心电图后，随即处死，取出心脏，生理盐水荡洗，吸水纸吸干表面液体，保鲜膜密封，标签编号，-20℃低温冷藏备用。
取出冷藏的小鼠心脏，解冻，准确称量待测心肌组织的重量，按照重量体积比1：19加生理盐水，在冰水混合物中制备成5%的组织匀浆。2000转/分，离心15分钟，取组织匀浆上清液，严格按照试剂盒说明书进行操作。
1．4．4考马斯亮蓝蛋白测定
取5%组织匀浆上清液，加生理盐水按照2:3稀释成2%组织匀浆。严格按照试剂盒说明书进行操作。
1．4．5 统计分析[3]
所得数据采用SPSS 15.0软件进行方差分析，以±s表示。组间均数比较运用SNK法，P<0.05或P<0.01为差别有统计学意义。
2．结果
实验过程中，我们通过观察小鼠灌胃后反应症状、毛色、死亡情况，各组没有明显差异，有个别小鼠死亡，可能是由灌胃操作造成创伤导致死亡；麻醉时亦出现个别小鼠死亡的情况，可能与小鼠个体差异、腹腔注射过快有关；心肌丙二醛（MDA）操作过程中，个别心肌标本丢失。以上死亡或者丢失者不计入统计，在此作以说明。
通过描记小鼠I、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF导联的心电图，我们发现Ⅱ导联可以观察到比较完整典型的各波段，而其他导联变化多样，难以辨识，故选取小鼠心电图Ⅱ导联进行统计分析，主要对心率、P-R间期、P波波幅、P波时间、QRS波时间进行了测定。
表1说明：与对照组相比，常规剂量瓜蒌组、常规剂量附蒌组均有增加小鼠心率的作用（P<0.01），与前两者相比，大剂量瓜蒌组时，心率显著降低（P<0.01）。然而，同一剂量水平的瓜蒌组、附子组、合用组之间并未出现显著差异（P>0.05）。组小鼠的QRS波时间总体没有显著性差异（F值对应P>0.05）。
表1各组小鼠心率、QRS波的测定（±s）
组别
N
心率（次/min）
QRS波时间（s）
对照组
8
250.94±55.45
0.0305±0.0071
小剂量附子组
7
278.58±40.07
0.0280±0.0101
小剂量瓜蒌组
9
271.62±41.33
0.0347±0.0069
小剂量附蒌组
8
285.68±44.84
0.0350±0.0050
常规附子组
9
279.62±48.90
0.0293±0.0094
常规瓜蒌组
9
342.02±47.40*
0.0267±0.0087
常规附蒌组
6
352.45±42.41*
0.0267±0.0103
大剂量附子组
9
268.46±67.18
0.0322±0.0067
大剂量瓜蒌组
8
253.56±83.46△
0.0350±0.0093
大剂量附蒌组
7
274.60±55.11
0.0257±0.0079
注:与对照组相比，*P<0.01；与常规瓜蒌组、常规附蒌组相比，△P<0.01。
各组小鼠之间的P波波幅、P波时间、P-R间期总体没有显著差异（F值对应P>0.05）。见表2。
表2各组小鼠P波、P-R间期的测定（±s）
组别
N
P波波幅（mV）
P波时间（s）
P-R间期(s)
对照组
8
0.1288±0.0551
0.0205±0.0014
0.0455±0.0091
小剂量附子组
7
0.1686±0.0376
0.0200±0
0.0400±0
小剂量瓜蒌组
9
0.1333±0.0773
0.0213±0.0033
0.0400±0
小剂量附蒌组
8
0.1500±0.0463
0.0208±0.0015
0.0410±0.0019
常规附子组
9
0.1333±0.0522
0.0200±0
0.0444±0.0088
常规瓜蒌组
7
0.1471±0.0472
0.0200±0
0.0400±0
常规附蒌组
6
0.1700±0.0369
0.0217±0.0041
0.0400±0
大剂量附子组
9
0.1822±0.0484
0.0202±0.0007
0.0441±0.0069
大剂量瓜蒌组
8
0.1688±0.0627
0.0213±0.0035
0.0388±0.0035
大剂量附蒌组
7
0.1814±0.0418
0.0206±0.0015
0.0429±0.0076
注：常规瓜蒌组有2只小鼠心电图没有P波、P-R间期，不计入统计。
表3说明：与对照组比较，常规剂量以上（包括常规剂量）的附子、瓜蒌单用组或者合用组，均能显著降低心肌MDA含量（P<0.01）；大剂量附子比小剂量附子具有更好的降低心肌MDA含量的作用（P<0.01）；常规剂量瓜蒌、大剂量瓜蒌比小剂量瓜蒌也具有更好的降低心肌MDA含量的作用（P<0.01）；大剂量附蒌合用比小剂量附蒌同样具有更好的降低心肌MDA含量的作用（P<0.01）。然而，同一剂量水平的瓜蒌、附子单用组、合用组之间并未发现显著差异（P>0.05）。
表3各组小鼠心肌组织中MDA含量的测定（±s）
组别
N
剂量（g/kg）
MDA（nmol/mgprot）
对照组
8
0.2mL
14.32±6.44
小剂量附子组
7
0.39
11.53±2.29
小剂量瓜蒌组
9
0.52
10.83±3.97
小剂量附蒌组
8
0.91
11.66±2.82
常规附子组
9
1.17
7.36±2.75*
常规瓜蒌组
9
1.56
6.10±2.28*△▲#
常规附蒌组
6
2.73
7.23±3.50*
大剂量附子组
9
3.51
6.04±3.17*△▲#
大剂量瓜蒌组
8
4.68
3.83±2.16*△▲#
大剂量附蒌组
7
8.91
3.11±1.27*△▲#
注:与对照组相比，*P<0.01；与小剂量附子组相比，△P<0.01；与小剂量瓜蒌组相比，▲P <0.01；与小剂量附蒌组相比，# P <0.01。
3．讨论
“本草明言十八反,半蒌贝蔹及攻乌, 藻戟遂芫俱战草,诸参辛芍叛藜芦。”（金·张从正《儒门事亲》）指出瓜蒌和乌头类药物相反。附子为乌头侧根，故后世将瓜蒌、附子列为中药配伍禁忌，认为两者不宜同用。
附子辛、甘、大热，有毒，归心、脾、肾经。具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛的功效，其性纯阳，刚烈迅捷，走而不守，通行十二经脉，是治疗阳衰阴盛，风寒湿痹，水湿肿满等病症要药。
但是，附子之毒不可小视。它引起的中毒情况不少，影响因素包括应用指征，应用剂量，煎服方法，炮制方法，附子的配伍[4]。如果药不对证，剂量过大，煎服时间不够，炮制不当，与其他药物配伍不当等，都有可能导致中毒的发生。附子的毒性在一定条件下是辨证存在的，只要合理用药、正确用药，可以避免或减少其毒性[5]。
瓜蒌性寒、味甘，具有清热涤痰、宽胸散结、润燥滑肠的功效。用于治疗肺热咳嗽，结胸痞满，胸痹心痛，肺痈，乳痈，肠痈肿痛，大便秘结等病症。瓜蒌与附子不同，基本没有什么毒性作用。
临床上关于附子、瓜蒌同用取效的案例较多。“风心”、“高心”、“冠心”等心脏病，在辨证为阳虚寒胜、痰浊蕴阻时，中医常有附子、瓜蒌合用的治法[6]。李氏等[7]用附子与半夏、瓜蒌、川贝母配伍，对消化、呼吸、循环系统等多种病证而属阳虚、寒凝、痰湿、血瘀的疗效十分满意。这些都提示附子、瓜蒌相反之说是令人质疑的。有人[8]认为附子不与瓜蒌配伍，可能是因为药物用量太大，或煎煮不当，或患者体弱不支，而出现中毒，甚至死亡。
心电图是目前诊断心脏功能的一个重要手段，通过观察心电变化，可以判断药物对心脏功能的影响。
本实验的心电图测量表明：瓜蒌或者附蒌合用均具有显著加快正常小鼠心率的作用，与剂量大小有关，大剂量时增加心率的作用不明显；在同剂量水平，附蒌合用与单用相比，对小鼠心率的影响并没有显著差异；附子组与对照组的心率没有明显差异；各组小鼠之间的P-R间期、P波波幅、P波时间、QRS波时间等均未见显著差异。
笔者认为，此结果受以下因素的干扰：首先在于小鼠本身，实验操作者抓小鼠进行麻醉心电图的过程中，对它们具有惊恐刺激的作用，这会影响小鼠的心电变化；其二，麻醉剂戊巴比妥钠对心脏有一定的抑制作用，影响心电变化[9] 。
因此，小鼠麻醉心电图测量的结果是粗略的，值得商榷。
丙二醛（MDA）是自由基损害多不饱和脂肪酸脂质过氧化的产物，为衡量机体自由基代谢的敏感指标，其含量的高低间接反映细胞受自由基攻击后脂质过氧化的严重程度，亦间接反映细胞受损伤的程度。故心肌组织中丙二醛（MDA）含量能够反映心肌细胞受损伤的程度。
本实验测定心肌丙二醛（MDA）含量表明：附子、瓜蒌均具有抗脂质过氧化、保护心肌细胞的作用。在同一剂量水平，附蒌合用与单味之间并没有表现出显著差异。
总体地说，从各组小鼠心电变化与心肌组织丙二醛（MDA）含量的比较，小剂量（附子3g、瓜蒌4g）、常规用量（附子9g、瓜蒌12g）、大剂量（附子27g、瓜蒌36g）三个剂量水平，同一比例（附子：瓜蒌=3：4），附蒌合用组与单味组之间无统计学意义（P>0.05），即没有显著差异。
由此，我们初步认为本实验中的附子、瓜蒌合用并没有产生心脏毒性，反之具有保护心脏的作用。所以从小鼠心脏功能方面来说，附蒌合用不存在相反作用。当然，因为只是选取几个指标进行的初步实验，如需要更精确的结论，有待人们从各个角度，更加全面、深入的研究。
参考文献
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