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抗片形吸虫疫苗研究进展
预防兽医学：莫秀玲 学号：0634304014
片形吸虫病是由肝片形吸虫(Fasciola hepatica)和大片形吸虫(F.giganica )引起反刍动物的一种常见寄生虫病。患病的动物生产能力降低,肉奶品质和产量下降,在世界范围内对畜牧业造成严重的经济损失。据报道,每年全世界造成农业和商业的损失达20亿美元。牛群感染率在非洲达30%～90%;泰国东部及北部多达85%以上,印度尼西亚达25%～90%。我国各地区、各种动物感染率不同,高的可达90%～100%,低的也在8%～15%。全世界除6亿动物被感染外,还有240万人被感染,1.8亿人受到此病的威胁[1]。
药物治疗是防治肝片吸虫病常用的方法, 但大量使用抗寄生虫药容易产生耐药性[2-3],并且往往有药物残留,严重影响了肉奶品质,因此在生产中迫切需求研制疫苗来防制片形吸虫病。1987年以前,一般用粗制虫体提取物、虫体分泌蛋白的混合物或辐照致弱虫体免疫农畜以抵抗片形吸虫。80年代以后的工作更多地集中于亚单元疫苗的研制。大量试验证实一些候选疫苗分子具有实际的保护作用。本文首先回顾候选抗原、疫苗分子的分子生物学研究结果，再介绍这些候选疫苗的生物学特性及可能的免疫机制。
1．疫苗战略和候选抗原
用于鉴定肝片吸虫和大片吸虫候选疫苗分子的三个基本战略:交叉保护抗原,由曼氏血吸虫抗体交叉反应识别的肝片吸虫抗原,能对曼氏血吸虫感染产生交叉保护力。这种标准抗原是脂肪酸结合蛋白(FABP)。同源抗原,是以前保护动物免受曼氏血吸虫和日本血吸虫感染的肝片吸虫同源抗原分子。这种标准抗原是谷胱苷肽巯基转移酶(GST)。必需抗原,预测肝片吸虫感染或存活功能必需的分子抗原,这种标准抗原是L-型组织蛋白酶(GatL)和血红蛋白。肝片吸虫(F·h)或大片吸虫(F·g)的4种候选抗原,已在牛和绵羊的接种试验中显示了有效性。
1.1交叉保护抗原
脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding proteins,FABP)是疫苗发展路上的一个经典例子。从肝片形吸虫中分离得到一种蛋白质的可溶性片段,命名为FhSmË(M)。它与从曼氏分体吸虫(Schistosomamansoni)分离得到的一种蛋白质有44%的同源性,全长只有一个氨基酸不同,具有交叉保护作用。随后FhSmË (M)被进一步分级, 得到的12kDa的纯化蛋白,命名为Fh12。Fh12能参与长链脂肪酸和酯酰辅酶A在细胞内的转运。它能明显减少曼氏分体吸虫对小鼠的感染。在交叉保护实验中重组的Sml4能够保护67%的小鼠免受曼氏分体吸虫的攻击和100%的小鼠免受肝片形吸虫的攻击,免疫兔能达到89%的保护率[4]。但是用重组的肝片形吸虫脂肪酸结合蛋白(recombinant FABP, recFABP)免疫牛、小鼠均未产生保护作用。免疫兔减虫率不显著,比天然FABP 的保护率低。分析其原因可能是recFABP 提呈的抗原表位与天然FABP 分子提呈的抗原表位不同。此外片形吸虫有几种FABP,我们所观察到的保护作用,可能是FABP当中的一个起作用,而recFABP可能与这个FABP成分不同。虽然recFABP在脂肪酸链试验表现出活性,但它比天然FABP低50%。FABP在5～22氨基酸含有保守的标记序列,它可能与FABP活性有很重要的关系,当recFABP的N端加上氨基酸可能影响recFABP 的免疫原性。因为FABP对曼氏分体吸虫和肝片形吸虫有交叉保护作用,因此是一种很有前景的候选疫苗分子。分体吸虫及其他一些吸虫不能合成长链脂肪酸,推测其可能依赖从宿主血清中转移脂肪酸前体以满足脂肪酸的需求。抗FABP疫苗能影响虫体脂肪酸摄取的过程。从大片形吸虫提纯出的FABP加弗氏完全佐剂(FCA )用于牛取得31%的减虫效果, 重组大片形吸虫FABP同样未表现出作用[5]。
1.2 同源抗原
肝片形吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-transferases,GST)作为候选疫苗抗原,源于用曼氏分体吸虫的同源GST免疫实验动物后产生明显减虫效果的启发。现已纯化了成虫F·h-GSTs, 并证实其至少由五种分子量为23～26kDa的同功酶组成,这些同功酶表现N-端片断异质性。也分离了F·g的GSTs。编码片形吸虫的cDNA克隆在GenBan数据库中有6个,并且在GenPep数据库中是6种相关的肽序列及几个部分序列。重组蛋白的酶学分析表明,GST s都将谷胱苷肽联结到普通的底物,1-氯2,4-二硝基苯上。与天然GST同功酶一样,它们也具有对抑制物敏感性和底物专一性的不同。编码F·h同功酶的克隆有4个,GST1,GST7,GST47和GST51。GST51多肽的抗血清与GST7,GST47有交叉反应。但与GST1不发生交叉反应。经免疫定位研究表明,它们具有组织特异性。GST1和GST51存在于成虫和幼虫的实质组织及幼虫的表皮下层部位实质细胞、胞浆的延伸部分以及排泄管;成虫的肠外层只有GST51,而幼虫肠外层未测到标记物。这些结果证实与幼虫相比,成虫有一种与肠道外层相关的GST,但不是GST1,并且表明成虫GSTs可能在成虫肠道吸收功能上起重要作用。
现已提出以GST s 作各种宿主寄生虫系统中免疫疗法的理想目标,其中包括F h。有趣的是自1988年Howell等的首次报道以来,人们发现用天然F·hGST同功酶可明显提高绵羊和牛抗F·h 感染的能力,但牛的保护力高低取决于佐剂的选择,而与GST的抗体滴度及中和抗体无关,并且不同品种牛的GST疫苗的反应程度不同。令人惊讶的是,尽管用了以前对F·h产生保护力的佐剂,但F.g GST对接种牛仍未产生显著保护力。这两种片形吸虫同源GST功效差别的根据还不清楚。另外,Hillyer等(1992)观察到接种FhSmË (M)的兔和犊牛产生了GST抗体,这表明FhSmË (M)(显然主要是FABP)中可能含有少量GST,FhSm Ë (M)的保护功效是否受少量GST的影响是值得考虑的问题.
1.3 必需抗原—组织蛋白酶
L-组织蛋白酶(Casthepsin-L,CatL)属于半胱氨酸家族。分子量为26～28kDa的蛋白酶活性最强。有几个实验室筛选cDNA 文库,并且分离得到编码成熟肝片形吸虫半胱氨酸蛋白酶全长的克隆,揭示了虫体分泌的成熟蛋白酶属于CatL。到目前为止, 在数据库中贮存有6种FhCatL完全序列。它们很相似,都包含有一个17个氨基酸的信号肽和一个90个氨基酸的前导区,形成326个氨基酸的蛋白质(有一种只含有325个氨基酸)。有两个半胱胺酸蛋白酶被纯化和鉴定,分别称为CatL1和CatL2。两者之间有87%氨基酸序列的同源性,它们具有不同的物理化学特性,对荧光多肽底物表现出独特的特异性,Spithill的实验室也从大片形吸虫的cDNA文库中分离得到两种CatL的cDNA,这些cDNA克隆翻译成的蛋白质相互之间有94.2%的同源性。与肝片形吸虫CatL有92.9%和94.2%的同源性[5]。
宿主体内的片形吸虫,在整个感染阶段都能分泌CatL1。CatL能降解细胞外基质和基底膜分子,如胶原蛋白I、III、IV,纤维结合素(fibronectin)和海带氨酸(Laminin), 帮助片形吸虫穿透组织。试验证实,CatL1能切割宿主免疫球蛋白Fc区, 并能阻止嗜酸性白细胞攻击新脱囊的童虫。CatL2 能切割纤维蛋白原,形成纤维凝块,一方面阻止了胆管内过多的出血, 利于虫体生存。另一方面又能阻止免疫效应细胞接近虫体表面。因此这种酶既能帮助吸虫在宿主体内移行和生存,又能帮助吸虫逃避宿主的免疫攻击[7]。此外CatL与片形吸虫产卵和获得营养都有很大关系。CatL可能在卵黄磷蛋白B的前体蛋白的加工过程中起着重要作用。此外CatL大量存在于成熟肝片形吸虫的梅氏腺中,梅氏腺细胞分泌的物质能够催化卵壳的形成。用CatL免疫的动物产生的免疫效应应答可能作用于梅氏腺体的CatL,从而影响卵壳的形成,造成产卵减少,或虫卵生命力降低[8]。
CatL用作疫苗抗原得到一些乐观的实验结果。Wijffels 等[9]证实用CatL/FCA免疫绵羊, 虽不能降低减虫率, 但却显著降低了成熟肝片形吸虫的生育力(69%),表明CatL对产卵有重要作用。Dalton等[10]用CatL/FCA和Hb(血红蛋白)FCA免疫牛能分别达到42%～69% 和43%的减虫率,如果用CatL/Hb/FCA能得到72%的减虫率, 并且两种疫苗有较高的减卵率。虽然影响产卵的机制尚未清楚, 但减卵率与抗体滴度并不相关。用CatL/DEAE免疫牛产生很高的抗体的滴度,却不能增加减虫率和减卵率。这些研究结果说明抗体滴度与保护率没有相关性,佐剂不同保护效果也不一样。
CatB也属半胱氨酸家族,现已鉴定出成虫幼虫cDNA文库中的cDNA片断,并通过免疫定位研究发现CatB存在于成虫实质组织、肠腔及幼虫肠上皮的分泌颗粒中。已报道了辐照会以剂量依赖的方式显著降低组织表达CatB,从而降低新胆囊F·h幼虫(NEJ)的ES中蛋白酶活性,该研究表明C2射线照射的NEJ改变了决定F·h免疫逃避的CatB蛋白酶表达,因为用10～40Kr辐照的囊蚴接种绵羊,其虫荷显著降低。
1.4必需抗原-血红蛋白
近来从成熟肝片形吸虫的ES物质中分离得到一种血红蛋白(Hb),分子量明显大于200kDa,N-端的序列与已知的血红蛋白没有任何相似之处。有人认为肝片形吸虫Hb有贮存和运输氧的作用,但确切的功能还不清楚。肝片形吸虫在胆管中起初为厌氧生物,这种蛋白质可能为在胆管的低氧环境中的氧化代谢过程提供氧。Dalton等[9]用FhCatL1、FhCatL2和Hb做了一系列免疫实验。单独用FhCatL1保护率为69% ,单独用Hb保护率为44%,两种抗原联合运用保护率为52%。用Hb和FhCatL2联合免疫,减虫率高达72%。更重要的是这种联苗也导致98%的减卵率。可能因为Hb传递氧减少的缘故。卵壳的形成需要氧化代谢过程,干扰这个过程就能影响肝片形吸虫的繁殖力。因此,用这样的联合疫苗不但减轻了对牛肝脏的损害,而且会显著降低牧场污染和重复感染,逐步减少免疫区的肝片形吸虫。
1.5 亮氨酸氨肽酶(Leuc ine am inopeptida se,LAP)
最近,分离得到一种亮氨酸氨肽酶(LAP),它是一种含锌的肽链端解酶。能特异性切割72氨基242甲基豆素亮氨酸。能水解多肽氨基酸端的氨基酸残基。此外,它还参与蛋白质的降解,蛋白质的成熟以及调节细胞代谢过程。用组织化学方法证实,LAP的活性与片形吸虫的消化道上皮细胞有关。这些酶很可能作用于多肽代谢的最后阶段。这些多肽是由诸如组织蛋白酶等内源蛋白酶降解宿主组织产生的。用亲和纯化的抗LAP抗体能够抑制LAP的活性,但抗体滴度与对宿主的保护率之间不存在显著联系,没有免疫的动物感染片形吸虫后也能产生低滴度的抗LAP抗体。说明这种酶在片形吸虫移行的早期阶段被呈递给宿主免疫系统。
LAP是一个很好的疫苗抗原分子,用CatL1,CatL2和LAP做成的三联苗免疫绵羊得到78%的保护率,如果单独用LAP能获得89%保护率[7]。据报道,从捻转血矛线虫(H .Contortus)小肠微绒毛得到的一种膜蛋白H-11,也是一种LAP。用H-11免疫绵羊,能明显保护绵羊感染捻转血矛线虫, 对雄虫有60%的减虫率,对雌虫有84%的减虫率,并能得到90%的减卵率。
1.6 副肌球蛋白(Paramyosin)
选择副肌球蛋白作为疫苗也是源于从人血吸虫和肝片形吸虫提取的这种抗原具有交叉保护作用。在绵羊的免疫试验中,佐剂FCA组的抗体滴度高,并且明显增加了减虫率。但在佐剂DEAE-dextranxeg组不能增加减虫率。在FCA组中有95% 减卵率,DEAE-dextranxek中有57%减卵率。在中和免疫试验中,用副肌球蛋白加佐剂QA/SM做了相似的试验,发现IgG的滴度比绵羊中的低得多,平均减虫率为47% , 然而,在以后的牛的免疫试验中不能产生这样的保护率,用大片形吸虫的副肌球蛋白在牛身上做的免疫试验,没有观察到保护效果。因此副肌球蛋白的是否能作为候选疫苗分子还有待进一步证实。
1.7 丝氨酸蛋白酶抑制剂(Kuntiz- type,KTM )
KTM属于牛胰蛋白酶的抑制剂家族成员,从肝片形吸虫分离得到的Kuntiz-type丝氨酸蛋白酶抑制剂(Fh-KTM),是胰蛋白酶的弱抑制剂,它存在于肝片形吸虫肠腔表面和包括包围口吸盘的体被组织在内的整个外周体被以及实质细胞的一些细胞器。用Fh-KTM/FCA对绵羊做了免疫保护试验和用Fh-KTM/quilA对牛做免疫保护试验发现,虽然绵羊免疫后能产生高的抗体滴度,但不能增加免疫动物的减虫率,对牛的免疫试验也得到同样的结果
2 展望
将来用免疫干预的方式控制片形吸虫病看来是正确的。但需要克服两个障碍: 其一,如前所述的CFA(FA)在商业中是不能接受的,需要研究新的佐剂;其二,必须研制与天然抗原诱导相当保护水平的重组分子,这不是简单的事。ITT绵羊显示的天生固有的获得性效应,能明显地抗F.g的研究,显然是一个重点,它为杀死该虫的免疫机制提供了一个新的视角,并可能导致鉴定出决定ITT绵羊抵抗力的候选基因。杀死大鼠和绵羊片形吸虫的效应的进一步体外研究是很重要的,因为这会为深入地了解体内可能效应的机制提供视野,将有助于疫苗设计和合理选择能适当提高杀虫效应的佐剂。绵羊、牛和大鼠感染过程中,T细胞反应受到抑制的现象, 可能是缘于动物感染F·h时整个免疫系统无Th1表型。详细研究F·h释放的抑制因子、并鉴定出能够作为免疫中和目标的一些分子,将会使宿主受益而损害寄生虫。
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