GA∕T 1608-2019 法庭科学 生物检材中河豚毒素检验 液相色谱-质谱法(公共安全).pdf

ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中河豚毒素检验 液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for tetrodotoxin in biological samplesLC-MS -发布 -实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 GA/T I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会 （SAC/TC 179/SC 1） 提出并归口。 本标准起草单位：司法鉴定科学研究院、公安部物证鉴定中心。 本标准主要起草人：刘伟、沈敏、卓先义、沈保华、向平、严慧、于忠山、王芳琳。GA/T 1 法庭科学 生物检材中河豚毒素检验 液相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容等）中河豚毒素的液相色谱-质谱（LC-MS）定性定量检验方法。 本标准适用于法庭科学生物检材中河豚毒素的定性、定量分析。其他可疑样品中河豚毒素的定性、定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相色谱-质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征碎片离子峰和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂及材料 5.1 试剂 试验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。试剂包括： a) 甲醇：色谱纯； b) 冰乙酸：分析纯； c) 浓盐酸：优级纯； d) 乙腈：色谱纯； e) 甲酸：优级纯； f) 0.1%甲酸溶液：移取 0.1mL 甲酸于 100mL 容量瓶中，用水定容至 100mL； g) 1%乙酸甲醇溶液：移取 1mL 冰乙酸于 100mL 容量瓶中，用甲醇定容至 100mL； h) 1%乙酸溶液：移取 1mL 冰乙酸于 100mL 容量瓶中，用水定容至 100mL； i) 流动相：乙腈:0.1%甲酸水溶液（体积比 90:10）； GA/T 2 j) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液：根据河豚毒素标准物质的纯度，称取适量，用甲醇配制 1mg/mL河豚毒素标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售标准溶液； 2) 10.0 g/mL 河豚毒素标准工作溶液：移取 1.0mg/mL 的河豚毒素标准物质溶液 0.1mL 于10mL 容量瓶中，用甲醇定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的标准工作溶液均由 1.0mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。 5.2 材料 材料包括： a) 固相萃取柱：Oasis MCX 固相萃取柱或等效固相萃取柱，使用前依次用甲醇、水活化； 注：Oasis MCX 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 一次性注射器； c) 有机系微孔滤膜：0.22m； d) 具盖离心管； e) 具塞玻璃试管。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱-质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆质量分析器； b) 固相萃取仪； c) 电子天平； d) 鼓风恒温干燥箱； e) 浓缩器； f) 振荡器； g) 离心机； h) 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 检材样品提取 7.1.1.1.1 血液、尿液固相萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL 于具盖离心管中， 加入 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL， 振荡， 13000r/min离心 3min， 取上清液转移至已活化好的固相萃取柱中， 控制上清液过柱流速为 0.5mL/min， 依次用 1mL乙腈、1mL 甲醇、1mL 水淋洗，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用 0.2mol/L 盐酸溶液/甲醇（体积比为 4：1）1mL 洗脱，洗脱液置于浓缩器上 60C 浓缩至干，残留物用流动相 200L 溶解，用有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液，供仪器分析。 GA/T 3 7.1.1.1.2 组织固相萃取 称取铰碎组织 0.5g 于具盖离心管中，用 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL 浸泡 2h 后，振荡，13000r/min 离心 3min，取上清液转移至已活化好的固相萃取柱上，其余按照 7.1.1.1.1 操作。 7.1.1.1.3 血液、尿液液液萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL 于具盖离心管中， 加入 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL， 混匀后 3500r/min离心 10min，取上清液，剩余检材再加入 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL，再次提取，合并上清液。将上清液在 60浓缩器中用空气流吹干，残留物用 1%乙酸溶液 0.25mL 复溶，再加入 0.25mL 氯仿，震荡后13000r/min 离心 3min，取上清液供仪器分析。 7.1.1.1.4 组织液液萃取 称取铰碎组织 0.5g 于具盖离心管中，用 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL 浸泡 2h 后，振荡，13000r/min 离心 3min，取上清液，剩余检材再加入 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL，其余按照 7.1.1.1.3 操作。 7.1.1.2 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加河豚毒素标准物质，使其含量为10ng/mL(g)，作为添加样品，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液，供仪器分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件（液相色谱-质谱条件） 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱：PC HILIC 柱（100mm2.0mm，5m）或等效色谱柱； 注：PC HILIC 是资生堂公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相：A：乙腈，B：0.1%甲酸溶液； c) 洗脱方式：梯度洗脱，梯度见表 1； 表 1 梯度洗脱程序 时间 min A B 0 90% 10% 0.8 90% 10% 1.2 20% 80% 2.5 20% 80% 4.0 90% 10% 10 90% 10% d) 流速：0.2mL/min； e) 柱温：室温； f) 进样量：5L； g) 离子源：电喷雾离子源（ESI）； h) 扫描方式：正离子； GA/T 4 i) 检测方式：多反应离子监测（MRM）； j) 离子源电压（IS）：5500V； k) 碰撞气（CAD）、气帘气（CUR）、雾化气（GS1)、辅助气（GS2）均为高纯氮气； l) 河豚毒素的 LC-MS 参数见表 2。 表 2 河豚毒素的 LC-MS 参数 名 称 定性离子对 定量离子对 去簇电压 V 碰撞电压 eV 保留时间 min 河豚毒素 320.1302.1 320.1302.1 90 35 6.74 320.1284.1 40 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液，按 7.1.2.1 的条件进样分析。空白血液、添加河豚毒素色谱图参见附录 A 中图 A.1、图 A.2。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品1.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品1.0g两份，按7.1.1进行操作。 另取等量相似基质的空白样品三份， 其中两份添加河豚毒素标准物质作为添加样品 （添加样品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的(100 50)%），另一份作为空白样品，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液，按 7.1.2.1 的分析条件每个样品进样分析 23 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析份数应不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 外标-单点校正法 记录各样品提取液中平行进样 23 次目标物的保留时间和峰面积值，按公式（1）计算含量： 添样添样添样VMAVMAW= . (1) 式中： W检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（ng/g）或微克每毫升（ng/mL）； A样检材样品提取液中目标物峰面积平均值； GA/T 5 M添添加样品中目标物添加量，单位为微克（g）； V样检材样品的定容体积，单位为毫升（mL）； A添添加样品提取液中目标物峰面积平均值； M样检材样品的取样量，单位为克（g）或毫升（mL）； V添添加样品的定容体积，单位为毫升（mL）。 7.2.3.1.2 外标-标准曲线法 在系列浓度河豚毒素添加样品中，以河豚毒素定量离子对的峰面积（Y）为纵坐标、河豚毒素含量（W）为横坐标进行线性回归，得线性方程。 根据检材样品中河豚毒素的峰面积值，按公式(2)计算河豚毒素含量： (2) 式中： W检材样品中河豚毒素的含量，单位为纳克每克（ng/g）或纳克每毫升（ng/mL）； Y 检材样品中河豚毒素峰面积平均值； a 线性方程的截距； b 线性方程的斜率。 7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（3）计算相对相差： (3) 式中： RD相对相差，用百分比（%）表示； X1、X2两个检材样品平行定量测定的含量数值； X两个检材样品平行定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时， 检材样品中河豚毒素的色谱峰保留时间与添加样品中的一致 （相对误差在 2.5%之内）、河豚毒素的定性离子对与添加样品的一致，且离子对丰度比与含量接近的添加样品相比，相对误差不超过表 3 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出河豚毒素。 表 3 离子丰度比的最大允许相对误差范围 GA/T 6 离子丰度比 50% 2050 1020 10% 最大允许相对误差 20 25 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与添加样品中河豚毒素一致的色谱峰， 且空白样品无干扰， 则可判断检材样品中未检出河豚毒素。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠。应按7.2重新提取检验。 8.3 相关资料 方法学有效性验证参见附录B，河豚毒素的中毒诊断参考资料参见附录C。 GA/T 7 A A 附录 A （资料性附录） 河豚毒素的相关谱图 空白血液、添加血液的色谱图见图 A.1、图 A.2。 图 A.1 空白血液的 MRM 色谱图 图 A.2 空白血液中添加 10ng/mL 河豚毒素的的 MRM 色谱图 GA/T 8 B 河豚毒素的河豚毒素的 B 附录 B （资料性附录） 方法学有效性验证 B.1 工作曲线、线性范围及检出限 数据采用：河豚毒素采用 320.1/302.1 离子对峰面积。 工作曲线方程、线性范围及检出限（LOD）见表 B.1。 表 B.1 工作曲线方程、线性范围及检出限 样品 目标物 回归方程 线性范围 ng/mL（g） r2 LOD ng/mL（g） 血液 河豚毒素 y =502x + 406 5-100 0.9984 2 尿液 河豚毒素 y =148x - 339 5-100 0.9993 2 肝组织 河豚毒素 y =382x + 2660 5-100 0.9973 4 B.2 精密度和回收率 精密度和回收率见表 B.2。 表 B.2 测定血液、尿液、肝组织中河豚毒素含量的精密度和回收率 样品 添加河豚毒素含量 ng/mL（g） 精密度（RSD） 回收率 日内精密度（n=6） 日间精密度（n=4） 血液 8 7.12% 10.77% 57.9% 40 4.76% 7.16% 56.8% 80 3.59% 5.32% 57.6% 尿液 8 8.13% 12.78% 68.3% 40 5.33% 7.90% 76.6% 80 5.05% 7.27% 87.1% 肝组织 8 8.55% 12.80% 49.6% 40 4.20% 7.53% 54.4% 80 6.70% 5.75% 53.3% GA/T 9 附 录 C （资料性附录） 河豚毒素中毒诊断参考资料 C.1 理化性质 河豚毒素（tetrodotoxin，简称TTX）系河豚体内所含剧毒成分。 TTX 分子式为 C11H17N3O8，分子量为 319.27。TTX 粗制品为棕黄色粉末，纯品为白色结晶性粉末，无臭、无味、易吸湿潮解，微溶于水、乙醇溶液，极易溶于稀酸水溶液，不溶于无水乙醇、乙醚、氯仿、苯等有机溶剂。在中性和酸性条件下对热稳定，如遇碱和强酸时易脱水、分解。 C.2 中毒机理 河豚毒素进入体内产生类似箭毒样作用，是细胞膜钠离子通道选择性阻断剂，可致细胞膜去极化，从而特异性地干扰神经-肌肉的传导过程， 主要表现为神经中枢和神经末梢的麻痹。 一般先是感觉神经麻痹，继而运动神经麻痹，使肢体无力甚至不能运动。血管中枢麻痹引起血压下降，脉搏迟缓。呼吸中枢麻痹导致呼吸停止而死亡。 C.3 中毒症状 中毒的原因多以误食或食用加工、烹调不得法的河豚鱼所致。河豚毒素中毒的症状主要为：舌尖及嘴唇发麻，进一步经上肢到足尖以致全身麻痹，有时还会出现运动障碍、头晕头痛、恶心呕吐、血压下降、呼吸困难，严重者因呼吸衰竭而死亡。 C.4 河豚毒素致死量 河豚毒素对人的致死量为 6g/kg7g/kg。最小急性中毒量和最小致死量分别为 0.2mg 和 2mg。 _