GA∕T 1619-2019 法庭科学 生物检材中灭多威和灭多威肟检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法(公共安全).pdf

ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中灭多威和灭多威肟检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for methomyl and methomyl oxime in biological samplesGC-MS and LC-MS -发布 -实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会 （SAC/TC 179/SC 1） 提出并归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心、运城市公安局。 本标准主要起草人：王瑞花、张云峰、常靖、任昕昕、王爱华、刘彦军。GA/T 1 法庭科学 生物检材中灭多威和灭多威肟检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容等）中灭多威及灭多威肟的气相色谱-质谱（GC-MS）定性检验方法和液相色谱-质谱（LC-MS）定性定量检验方法。 本标准适用于生物检材中灭多威和灭多威肟的定性分析和定量分析。 其他可疑样品中灭多威及灭多威肟的定性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用气相色谱-质谱法定性，液相色谱-串联质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 气相色谱-质谱实验用水应符合GB/T 6682中规定的三级水，液相色谱-串联质谱实验用水应符合GB/T 6682中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括： a) 甲醇； b) 乙酸乙酯； c) 二氯甲烷； d) 中性氧化铝或硅镁吸附剂； e) 乙腈（色谱纯）； f) 丙酮； g) 甲酸（色谱纯）； h) 无水硫酸钠； i) 标准溶液： GA/T 2 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液：根据灭多威和灭多威肟标准物质的纯度，各称取适量，分别用甲醇配制 1.0mg/mL 灭多威和灭多威肟标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售标准溶液； 2) 0.1mg/mL 混合标准工作溶液： 移取 1.0mg/mL 的灭多威和灭多威肟标准物质溶液各 1.0mL，用甲醇定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的混合标准工作溶液均由 0.1mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到； 3) 10.0g/mL 灭多威和灭多威肟单一标准工作溶液：移取 1.0mg/mL 的灭多威和灭多威肟标准物质溶液各0.1mL于10mL容量瓶中， 用甲醇稀释至刻度， 混匀， 配制成浓度为10.0 g/mL的单一标准工作溶液，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 1 个月。实验中所用其他浓度的单一标准工作溶液均由 10.0g/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管； b) 具塞玻璃试管； c) 固相萃取柱：Oasis HLB 柱或等效固相萃取柱，依次用甲醇、水活化； 注：Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 d) 一次性注射器； e) 有机系微孔滤膜：0.22m。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 气相色谱-质谱仪：配有电子轰击源（EI） ； b) 液相色谱-质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆质量分析器； c) 电子天平； d) 离心机； e) 振荡器； f) 移液器； g) 浓缩器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体检材样品1.0mL2.0mL， 或称取铰碎的肝脏等固体检材样品1.0g2.0g于具盖离心管中，加入乙酸乙酯4.0mL8.0mL，振荡5min，8000r/min离心10min，分离有机相；重复提取一次，合并两次提取的有机相， 用无水硫酸钠脱水后， 置于浓缩器上45浓缩至干， 残留物用甲醇200L溶解，GA/T 3 作为检材样品提取液供GC-MS分析或用0.22m的有机系微孔滤膜过滤，供LC-MS分析。如需净化，按7.1.1.4操作。 7.1.1.2 丙酮/水混合溶剂提取 移取血液等液体检材样品5.0mL10.0mL，或称取铰碎的固体检材样品5.0g10.0g，用丙酮/水混合溶剂（体积比4:1）50mL100mL浸泡3h以上（或超声1h以上）。8000r/min离心10min，分离上清液，置于水浴锅上50浓缩至2mL左右， 离心， 取上清液移至离心管中， 再加入乙酸乙酯6.0mL， 振荡10min，8000r/min离心10min，分离有机相，重复提取一次，合并两次提取的有机相，置于浓缩器上45浓缩至干，残留物用甲醇200L溶解，作为检材样品提取液供GC-MS分析或用0.22m的有机系微孔滤膜过滤，供LC-MS分析。如需净化，按7.1.1.4操作。 7.1.1.3 固相萃取 移取血液等液体检材样品1.0mL2.0mL， 或称取绞碎的肝脏等固体检材样品1.0g2.0g于具盖离心管中，用4倍体积水稀释，振荡10min，8000r/min离心20min，取上清液转移至已活化好的C18固相萃取柱中，控制上清液过柱流速为0.5mL/min过柱，依次用1mL水、1mL甲醇/水 (体积比5:95)淋洗，抽干弃去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱2min，用2mL乙酸乙酯或乙酸乙酯/二氯甲烷（体积比1:1）洗脱，控制流速为0.5mL/min，收集洗脱液并置于浓缩器上45浓缩至干，残留物用甲醇200L溶解，作为检材样品提取液供GC-MS分析或用0.22m的有机系微孔滤膜过滤，供LC-MS分析。如需净化，按7.1.1.4操作。 7.1.1.4 样品净化（中性氧化铝柱净化法） 净化过程包括： a) 装柱：少许脱脂棉，依次加入无水硫酸钠 1g2g、中性氧化铝 2g5g 或硅镁吸附剂、无水硫酸钠 2g3g； b) 净化：用与提取液相同的溶剂 6.0mL 预淋洗装好的柱子，弃去预淋液，将检材样品提取液过柱，再用与提取液相同的溶剂 6.0mL 洗脱。收集合并过柱液及洗脱液，置于浓缩器上 45浓缩至干，用 200 L 甲醇溶解，供 GC-MS 分析或用 0.22m 的有机系微孔滤膜过滤，供 LC-MS分析。 7.1.1.5 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加灭多威或灭多威肟标准物质，作为添加样品（GC-MS添加样品的浓度为1.0 g/mL(g)，LC-MS添加样品的浓度为20ng/mL(g)），与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 气相色谱-质谱条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱：HP-5柱（30m 0.25mm，0.25m）或等效色谱柱； 注：HP-5 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认 可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 色谱柱温程：100保持2min，以30/min速率升至280，保持17.5min； GA/T 4 c) 柱流速：1mL/min； d) 进样口温度：280； e) 传输线温度：230； f) 离子源温度：230； g) 电子轰击能量：70eV； h) 载气：高纯氦； i) 进样方式：分流进样，分流比：10:1； j) 扫描方式：全扫描（SCAN），质量扫描范围40 amu450 amu； k) 灭多威和灭多威肟（灭多威分解产物）的保留时间、特征离子见表1。 表 1 灭多威和灭多威肟的保留时间及定性离子 化合物 保留时间 min 定性离子 灭多威 3.57 58,88,105,162 灭多威肟 4.47 58,88,105 7.1.2.1.2 液相色谱-质谱条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1mm 50mm，1.7m)或等效柱； 注：ACQUITY UPLC HSS T3是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相：A：乙腈，B：0.1%甲酸； c) 洗脱方式：梯度洗脱，梯度见表2； 表2 梯度洗脱条件 时间 min 流速 mL/min A B - 0.5 10% 90% 1.5 0.5 40% 60% 2.0 0.5 40% 60% 2.2 0.5 10% 90% 3.5 0.5 10% 90% d) 柱温：35； e) 离子源：电喷雾电离源（ESI）； f) 检测方式：正离子； g) 扫描方式：多反应离子监测（MRM）； h) 雾化气、脱溶剂气：氮气； i) 碰撞气：氩气； j) 离子源温度：150； k) 雾化温度：350 l) 毛细管电压：3.0kV； m) MS参考条件（定性、定量离子对和锥孔电压、碰撞能量）见表3。 GA/T 5 表 3 MS 参考条件 名 称 定量离子对 定性离子对 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 灭多威 162.9105.9 162.96105.9 12 8 162.9687.9 8 灭多威肟 105.957.9 105.957.9 20 10 105.972.8 18 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品1.0mL5.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品1.0g5.0g两份，按7.1.1进行操作。 另取等量相似基质的空白样品三份，其中两份分别添加灭多威和灭多威肟标准物质作为添加样品（添加样品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的(100 50)% ），另一份作为空白样品，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1.2 规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、 空白和添加样品提取液及标准工作溶液， 按 7.1.2.1.2 的分析条件每个样品进样分析23 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品提取液平行进样 23 次的目标物保留时间和峰面积值，按公式（1）计算含量： 添样添样添样VMAVMAW= . (1) 式中： W检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（g/mL） ； A样检材样品提取液中目标物峰面积平均值； M添添加样品中目标物添加量，单位为微克（g） ； V样检材样品的定容体积，单位为毫升（mL） ； A添添加样品提取液中目标物峰面积平均值； M样检材样品的取样量，单位为克（g）或毫升（mL） ； V添添加样品的定容体积，单位为毫升（mL） 。 7.2.3.2 计算相对相差 GA/T 6 记录 2 份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（2）计算相对相差： %10021=XXXRD . (2) 式中： RD相对相差，用百分比（%）表示； X1、X2两个检材样品平行定量测定的含量数值； X两个检材样品平行定量测定含量的平均值。 8 分析结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 气相色谱-质谱 阳性结果评价： 在相同条件下进行样品测定时， 检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 1%之内），且在扣除背景后的检材样品质谱图中，目标物的质谱特征离子（不少于 3个）与标准溶液一致，特征离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表 4 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。灭多威和灭多威肟的 GC-MS 相关谱图参见附录 A中图 A.1图 A.3。 表 4 特征离子丰度比的最大允许相对偏差范围 特征离子丰度比 50% 2050 1020 10% 最大允许相对偏差 10 15 20% 50% 阴性结果评价： 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰， 且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。GC-MS 方法检出限参见附录 A。 8.1.2 液相色谱-质谱 阳性结果评价： 在相同条件下进行样品测定时， 检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表 5 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。灭多威和灭多威肟的 LC-MS 相关谱图参见附录 A 中图 A.4 和图 A.5。 表 5 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50% 2050 1020 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 阴性结果评价： 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰， 且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。LC-MS 方法检出限参见附录 A。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠。应按7.2重新提取检验。 GA/T 7 附 录 A （资料性附录） 灭多威和灭多威肟相关资料 A.1 灭多威（分子式为 C5H10N2O2S，又名万灵、快灵，CAS：16752-77-5） ，是一种高毒广谱型氨基甲酸酯类杀虫剂，并具有药效迅速、渗透力强、分解快、残留低等特点。在通风时、日光下、碱性介质中或在较高温度下迅速分解成灭多威肟（分子式为 C5H10N2O2S） ，其分解过程如下： CH3CNOCNHCH3CH3CNOHSCH3OSCH3OH灭多威灭多威肟CH3CNOCNHCH3CH3CNOHSCH3OSCH3SCH3OHOH灭多威灭多威肟 A.2 灭多威和灭多威肟的 GC-MS 总离子流图见图 A.1。 图A.1 GC-MS分析灭多威（2g/L）总离子流图 A.3 灭多威和灭多威肟的特征离子质谱图分别见图 A.2 和图 A.3。 图A.2 灭多威特征离子质谱图 GA/T 8 501001502002503003504004505005500102030405060708090100%581058842207324391182546457128300367488416261510 图A.3 灭多威肟特征离子质谱图 A.4 灭多威的LC-MS色谱质谱图见图A.4。 50ng ST10-Dec-201023:22:14Time0.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.40%00.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.40%00.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.202.402.602.803.003.203.40%020101210Methomyl STD-10MRM of 2 Channels ES+ 162.964 105.977 (Methomyl)7.23e51.2020101210Methomyl STD-10MRM of 2 Channels ES+ 162.964 87.949 (Methomyl)1.00e61.2120101210Methomyl STD-10MRM of 2 Channels ES+ TIC (Methomyl)1.69e61.20 图A.4 灭多威LC-MS色谱质谱图 A.5 灭多威肟的LC-MS色谱质谱图见图A.5。 mieduoweiwu STTime0.501.001.502.002.503.003.504.004.50%01000.501.001.502.002.503.003.504.004.50%01000.501.001.502.002.503.003.504.004.50%010020171121-2MRM of 2 Channels ES+ 105.968 72.85 (mieduoweiwu)8.98e4Area1.05208820171121-2MRM of 2 Channels ES+ 105.968 57.977 (mieduoweiwu)1.57e7Area1.053779971.08326020171121-2MRM of 2 Channels ES+ TIC (mieduoweiwu)1.58e7Area1.053800891.083278 图A.5 灭多威肟LC-MS色谱质谱图 GA/T 9 A.6 GC-MS分析，灭多威和灭多威肟的检出限均为500ng/ mL（g）；LC-MS分析，灭多威和灭多威肟的检出限均为10ng/mL（g）。 _