第6章生化药物制造工艺核酸药物.ppt

核核 酸酸 药药 物物nucleic acid medicine依据化学结构和组成分类：分四类依据化学结构和组成分类：分四类核酸碱基及其衍生物核酸碱基及其衍生物1核苷及其衍生物核苷及其衍生物2核苷酸及其衍生物核苷酸及其衍生物3多核苷酸多核苷酸4依据结构特点及临床应用情况分类依据结构特点及临床应用情况分类具有天然结构的核酸类物质具有天然结构的核酸类物质u如：肌苷、如：肌苷、ATP、GTP、CTP、UTP、Co 等等u来源：提取或发酵来源：提取或发酵u特点：毒副作用小特点：毒副作用小自然结构碱基、核苷、核酸类结构的类似物自然结构碱基、核苷、核酸类结构的类似物u如：巯嘌呤、阿糖胞苷、聚肌胞等如：巯嘌呤、阿糖胞苷、聚肌胞等u来源：以核酸类物质为前体通过来源：以核酸类物质为前体通过“化学法化学法”或或“酶法酶法”进行半合成进行半合成u特点：毒性较大特点：毒性较大RNA的生产的生产工业用工业用RNA的提的提取取RNA制备制备具有生物具有生物活性活性RNA的制备的制备.1、工业用RNA的提取稀稀碱碱法法酵母等1 1NaOHNaOH裂裂解胞壁解胞壁溶液HCLHCL中和中和加热破坏酶加热破坏酶冷却到冷却到1010O OC C离心离心RNA溶液调调pH2-2.5pH2-2.5（接近（接近RNAplRNApl）离心离心RNA沉淀浓浓盐盐法法酵母等1010NaCLNaCL9090O OC C提取提取离心离心上清液调调pH2-2.5pH2-2.5离心RNARNA沉淀沉淀2、具有生物活性RNA的制备从核糖核蛋白中分离RNA(1)(1)乙醇沉淀法：乙醇沉淀法：核糖核蛋白溶于溶于NaHCONaHCO3 3水相用含辛醇的用含辛醇的氯仿去蛋白氯仿去蛋白乙醇乙醇RNA沉淀(2)(2)盐酸胍法：盐酸胍法：核糖核蛋白2 24 4盐酸胍盐酸胍3838O OC C溶解溶解冷却至冷却至0 0O OC C离心离心RNA沉淀 DNA生产方法生产方法1.工业用工业用DNA的提取的提取核苷酸的制备核苷酸的制备水解法水解法发酵法发酵法半合成法半合成法直接提取法直接提取法.酶水解酶水解:DNA或或RNA为原料制备为原料制备5核苷酸核苷酸常用的酶：橘青霉产生的常用的酶：橘青霉产生的5磷酸二酯酶磷酸二酯酶橘青霉橘青霉培养液培养液压滤压滤酶液酶液【酶解酶解】除菌体除菌体DNA溶液酶解液加热、调加热、调pH9.0pH9.0过滤过滤DNA降解液【离子交换离子交换】吸附于氯型阴离子树脂吸附于氯型阴离子树脂分部洗脱分部洗脱脱氧核苷酸(dCMP、dAMP、dTMP、dGMP)RNA降解降解进一步分离进一步分离戊糖核苷酸碱水解碱水解：可制备：可制备3 3和和2 2核苷酸核苷酸发酵法生产核苷酸发酵法生产核苷酸产氨短杆菌发酵生产肌苷酸（产氨短杆菌发酵生产肌苷酸（IMP）：腺嘌呤营养缺陷型）：腺嘌呤营养缺陷型嘌呤核苷酸生物合成途径和代谢调控嘌呤核苷酸生物合成途径和代谢调控 R5PPRPPPRPP转酰胺酶PRAIMP分解腺嘌呤阻遏GMPAMPADPATP反馈抑制SAMPAMPADPATPXMPGMPGDPGTP鸟嘌呤PPGMPATPPRPPGTP次黄嘌呤鸟嘌呤GMPIMP积累的主要途径（前提）保证保证IMP合成路线畅通：合成路线畅通：保证关键酶保证关键酶PRPP转酰胺酶的活力转酰胺酶的活力-解除腺嘌呤及衍解除腺嘌呤及衍生物的组遏和反馈抑制生物的组遏和反馈抑制阻断阻断IMP的去路：的去路：阻断阻断SAMP合成合成 阻断阻断IMP的分解的分解l筛选获得缺乏筛选获得缺乏SAMP合成酶的腺嘌呤缺合成酶的腺嘌呤缺陷菌株，提供亚适量的腺嘌呤。陷菌株，提供亚适量的腺嘌呤。使积累的使积累的IMP渗透到细胞外：渗透到细胞外：增大细胞膜通透性增大细胞膜通透性l选育选育Mn2+不敏感的变异株不敏感的变异株发酵法生产核苷发酵法生产核苷枯草芽孢杆菌嘌呤核苷酸合成途径枯草芽孢杆菌嘌呤核苷酸合成途径SAMPAMPIMPGMPXMP345678黄嘌呤缺陷型（II）鸟嘌呤缺陷型（经诱变缺失4号酶）（III）鸟嘌呤缺陷型（经诱变缺失4号酶）腺嘌呤缺陷型（经诱变缺失6号或7号酶）AICARSAICARPRAPRPP21（一）（一）（一）（一）1：PRPP转酰胺酶2、7：SAMP裂解酶3：IMP脱氢酶4：XMP氨化酶5：GMP还原酶6：SAMP合成酶8：AMP脱氢酶当培养基中提供限量腺嘌呤时当培养基中提供限量腺嘌呤时 积累积累IMP IMP 肌苷肌苷 积累积累IMP IMP 肌苷肌苷 积累积累XMP 黄苷黄苷 枯草杆菌的磷酸单酯酶活力很强枯草杆菌的磷酸单酯酶活力很强ADP（）nucleic acid medicine