GB∕T 36190-2018 草鱼出血病诊断规程.pdf

书 书 书犐 犆犛 犅 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准犌犅犜 草鱼出血病诊断规程犘 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾狅 犳犱 犻 犪 犵 狀 狅 狊 狋 犻 犮犿犲 狋 犺 狅 犱 狊犳 狅 狉犺 犲犿狅 狉 狉 犺 犪 犵 犻 犮犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲狅 犳犵 狉 犪 狊 狊犮 犪 狉 狆 发布 实施国 家 市 场 监 督 管 理 总 局中国国家标准化管理委员会发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会（ ）归口。本标准起草单位：浙江省淡水水产研究所、中国检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：沈锦玉、潘晓艺、郝贵杰、徐洋、江育林、陈爱平、高隆英、袁雪梅、尹文林、姚嘉?、蔺凌云。犌犅犜 草鱼出血病诊断规程范围本标准规定了草鱼出血病诊断的临床症状、采样、病毒分离和鉴定以及综合判定。本标准适用于草鱼出血病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 出入境动物检疫采样 鱼类细胞系第部分：草鱼卵巢细胞系（） 水生动物产地检疫采样技术规范缩略语下列缩略语适用于本文件。：鸟类成髓细胞性白血病病毒（ ） ：碱基对（ ）：互补脱氧核糖核酸（ ）：草鱼卵巢细胞系（ ）：细胞病变效应（ ）：十六烷基三甲基溴化铵（ ）：脱氧核糖核苷三磷酸（ ）：脱氧腺苷三磷酸（ ）：脱氧胞苷三磷酸（ ）：脱氧鸟苷三磷酸三钠（ ）：脱氧胸苷三磷酸（ ）：溴化乙啶（ ）：乙二胺四乙酸（ ） ：酶联免疫吸附试验（ ）：胎牛血清（ ）：草鱼呼肠孤病毒（ ）： 羟乙基哌嗪乙磺酸 （ ） ：辣根过氧化物酶（ ）：主要衣壳蛋白（ ）：磷酸盐吐温缓冲液（ ） ：逆转录聚合酶链式反应（ ）犌犅犜 ：核糖核酸（ ） ：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ ）：三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液（ ）试剂和材料 琼脂糖：电泳级。 邻苯二胺：分析纯。 逆转录酶： ， 保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 酶抑制剂（ ） ： 保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 ：含、各 ， 保存。 犜犪 狇酶： ，保存温度为 ，同时应避免反复冻融或温度剧烈变化。 无水乙醇：分析纯，使用前预冷到 。 分子量标准： ，保存。 辣根过氧化物酶（）标记的抗鼠抗体： 保存。 过氧化氢：分析纯。 参考株： 株（型） 、 株（型） 、 株（型） 。注：由农业部相关部门指定机构提供。 羊抗免疫球蛋白： 保存。注：由动物防疫管理部门指定单位提供。 鼠抗单克隆抗体： 保存。注：由动物防疫管理部门指定单位提供。 鱼类细胞系：应符合 的规定。 水： 中一级水，核酸抽提和 须使用无酶的去离子水。 鱼类细胞培养液：用含厄尔平衡盐（ ）的 培养基配制（见附录中 ） ，或其他商品化的细胞培养基，另加 胎牛血清（） 。 鱼类细胞维持液：用含厄尔平衡盐（ ）的 培养基配制，另加胎牛血清（） 。 细胞消化液：见 。 逆转录酶缓冲液和犜犪 狇酶缓冲液：分别见 、 。 电泳缓冲液：电泳缓冲液（倍浓缩液，见 ） 。 ： ，保存温度为 。 包被稀释液：为 、 的碳酸盐缓冲液（见 ） 。 封闭液：明胶（用包被稀释液配制） 。 终止液： 的硫酸。 依据型中 片段序列设计引物，扩增 中的 片段（见附录中 ） ： 正向引物： ； 反向引物： 。 依据 型的片段序列设计引物，扩增中的 片段（见 ） ： 正向引物： ； 反向引物： 。犌犅犜 依据 型的片段序列设计引物，扩增中的 片段（见 ） ： 正向引物： ； 反向引物： 。器材和设备 倒置显微镜。 生化培养箱。 普通冰箱和超低温冰箱。 组织研磨器。 冷冻离心机。 生物安全柜或超净工作台。 仪。 电泳仪、水平电泳槽和垂直电泳槽。 微量移液器。 凝胶成像仪或紫外透射仪。 高压灭菌锅。 微波炉。 水浴锅。 制冰机。 磁力搅拌器。 过滤系统。 酶标仪和洗板机。临床症状病鱼眼球突出、体色发黑，口腔、鳃盖和鳍条基部出血。撕开表皮，可见肌肉出现点状或块状出血。剖检腹腔，可见肠道充血，肝、脾充血或因失血而发白。根据出血部位可将此病分为“红肌肉” “红肠子”“红鳍红鳃盖”三类。病鱼可以有其中一种或几种临床症状。采样 采样对象草鱼、青鱼等易感鱼类。 采样数量采样数量应符合 的要求。 样品采集按 的规定执行，体长的鱼去尾后取整条（尾）鱼；体长为（含）的鱼，取脑、内脏（包括肾） ；体长的鱼则取脑、肝、肾和脾。犌犅犜 病毒分离和鉴定 病毒分离培养 样品处理最多每尾鱼设为个合并样，将样品匀浆成糊状，用含 青霉素和 链霉素的鱼类细胞培养液按 稀释。置于 下孵育或下孵育过夜后 犵离心 ，收集上清液。 病毒分离对 的组织匀浆上清液再作两次 倍稀释。然后将 、 和 三个稀释度的上清液各 分别接种到生长约 的（见图 ）单层细胞的 孔板中， 吸附后，加入细胞维持液，置于 培养。试验中设孔阳性对照即接种 株和孔空白对照即未接种病毒的细胞。内每天用 倍和 倍倒置显微镜检查。空白对照细胞形态应保持正常，阳性对照细胞应出现。若接种了被检匀浆上清稀释液的细胞出现（见图 ）时，应立即进行鉴定；若无出现，则需盲传次。盲传时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融次，以 犵，离心 ，收集上清液。将 上清液接种到新鲜单层细胞的 孔板中， 培养。期间每天用 倍和 倍倒置显微镜检查。盲传后仍无出现，则仍然需要做进一步鉴定。不同基因型感染敏感细胞后表现出的特征为： （型代表株）能在等草鱼敏感细胞系中大量增殖并出现； （型代表株）能在等草鱼敏感细胞系中大量增殖，但不产生； 株（ 型代表株）很少存在，也不产生。 病毒分离结果判定有临床症状的鱼，检测样品上清液接种细胞后，若出现，可判断为疑似携带型或型。 犚犜 犘犆犚 犚犖犃提取 对照设置在样品处理过程中应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。 取含有 参考株和 参考株细胞悬液，同时取含有 参考株细胞悬液或含有病毒目的片段的非感染性体外转录作为阳性对照； 取正常的细胞悬液作为阴性对照； 取等体积的水代替模板作为空白对照。 样品处理将 细胞悬液或组织匀浆上清液放入 的离心管，再加入 溶液（见 ）并混匀， 作用 。犌犅犜 犚犖犃抽提在含有 样品处理液的离心管中加入 抽提液（见 ） ，用力混合至少 。 、离心 ，小心吸取上层水相（约 ）于新离心管中。再加入 抽提液（见 ） ，用力混合至少 。 、离心 ，小心吸取上层水相（约 ）于新离心管中。再加入 预冷的 倍体积的无水乙醇（约 ） ，倒置数次混匀后， 以上沉淀核酸。 、离心 ，小心弃去上清。沉淀干燥后加 无酶的去离子水溶解，用作 模板。也可以采用商品试剂盒抽提病毒核酸，其方法按商品说明书进行。提取的应在内进行 扩增；若需长期保存应置于 冰箱中。 犚犜 犘犆犚扩增 犮犇犖犃合成根据样品数量犖，在离心管中分别加入 、 和 中的每条引物各犖，混匀制成犖的引物预混液。在另一只离心管中，分别加入犖倍逆转录酶缓冲液（见 ） 、犖、犖 的酶抑制剂、犖 的逆转录酶和犖 无酶的去离子水，混匀制成犖的反转录预混液。在反应管中加入 模板，再加入上述引物预混液，至总体积 。 变性 。立即冰浴，低速离心约，使液体集中在底部。在上述反应管中，再加入的反转录预混液，至总体积 。 反应 以合成。 犇犖犃扩增根据样品数量犖，在离心管中分别加入犖 倍犜犪 狇酶用浓缩缓冲液（见 ） 、犖 的 、犖、三对引物每种各犖、犖 的犜犪 狇酶、犖无酶的去离子水，混匀后按每反应管 分装，最后在各反应管中分别加入 合成的，使得各管总体积 。如果仪没有热盖，每管还需加入 矿物油。低速离心，以使试剂集中在底部。再将反应管置于扩增仪中。 预变性 ，再按以下程序进行扩增反应： ， ， ， 个循环； 延伸 ，保温。 琼脂糖电泳用缓冲液（见 ）制备的琼脂糖（含 ，见 ）凝胶平板。将其放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面，将扩增产物和样品缓冲液（见 ）混匀后加入样品孔。在电泳时设立分子量标准。电泳约 ，当溴酚蓝到达底部时停止，在紫外透射仪或凝胶成像仪下观察。 结果判定电泳后经观察 参考株阳性对照应出现 （见图 泳道） ，或 参考株阳性对照应出现 （见图 泳道） ，或 参考株阳性对照应出现 （见图 泳道）的片段，阴性对照和空白对照均无该核酸带。待测样品 扩增后能在相应 位置上有带，或者能在相应 位置上有带，或者能在相应 位置上有带，均可判为阳性。无带或带的大小不是 、 和 的均判为阴性。犌犅犜 阳性对照无特定条带出现或阴性对照或空白对照有条带出现都表明失败，应在排除故障和清除污染后，重新取样检测。 直接电泳检测病毒核酸 犚犖犃抽提采用 的方法抽提获得病毒。 核酸电泳按常规方法配制的 胶做垂直电泳，电泳结束后用常规方法银染或者染色，观察电泳结果。 结果判定基因组电泳后能看到 条核酸带，根据片断长度大小， 个片段可分为组，即条大片段（，大小分别约为 ） 、条中等片段（，大小分别约为 ）和条小片段（ ，大小分别约为 ） ，当样品 胶做垂直电泳能看到明显的 个核酸带时可判定为阳性（见图 ） 。 犈犔 犐 犛犃检测 包被用 的包被稀释液（见 ）按照说明书指示适量稀释纯化的羊抗免疫球蛋白（ ）包被 板，每孔 。孵育过夜。次日用含 表面活性剂吐温 （ ）的 （，见 ）洗次。 封闭用明胶（溶于中）封闭，每孔 。 反应 后，洗次。 加样加入待测的样品，阳性对照和阴性对照，每孔 ， 反应。洗次。 加单抗按照说明书要求加稀释到一定浓度的鼠抗单克隆抗体到小孔中，每孔 ， 反应 。洗次。 去除非特异性加入 （用蒸馏水稀释） ，去除非特异性过氧化物酶。每孔 ， 反应 。洗次。 加酶标抗抗体加入标记辣根过氧化物酶的抗鼠 抗体（酶标二抗） ，每孔 ， 反应 。洗次。 加底物显色加入底物（见 ） ，每孔 ， 反应。当阳性对照出现明显蓝色，阴性对照无色时加入终犌犅犜 止液，在 波长下读取结果。底物改用邻苯二胺（）或其他底物，应改用 或相应波长测量。 结果判定测量各孔的光吸收值后，计算值。如果阳性对照孔 ，表明对照成立。再计算待测样品孔的值。当 时判为阳性。当 时判为阴性。注：按公式（待检测孔空白对照） （阴性对照空白对照） 。综合判定 确诊病例的判定易感鱼类在发病条件下出现典型临床症状，且经过细胞分离病毒后，无论是否出现，用 、 、直接电泳检测病毒核酸方法中的一种，其结果为阳性即可确诊为草鱼出血病；如果直接将病鱼组织匀浆上清液用 、 、直接电泳检测病毒核酸方法中的一种，其结果为阳性即可确诊为草鱼出血病。 疑似携带或携带草鱼呼肠孤病毒的判定 疑似携带草鱼呼肠孤病毒的判定无临床症状或临床症状不典型的鱼类，但能直接从鱼组织匀浆上清液中用 、 或者直接电泳观察核酸带中任何一项结果为阳性，即可判断为疑似携带草鱼呼肠孤病毒。 携带草鱼呼肠孤病毒的判定无临床症状或临床症状不典型的鱼类，但能直接从鱼组织匀浆上清液中用 、 或者直接电泳观察核酸带中其中二项为阳性，或者经过细胞分离病毒后，用、 或直接电泳观察 条核酸带中任何一项结果为阳性，即可判断为携带草鱼呼肠孤病毒。犌犅犜 附录犃（规范性附录）试剂及其配制犃 细胞培养液按 培养基（含 盐）说明书的要求，用一级水配制，然后加入 经 灭活的胎牛血清，用碳酸氢钠粉末调节培养液为 。过滤除菌，分装后 保存。在开放系统使用时，需要加入过滤除菌的，使其在培养液中的终浓度为 。犃 细胞消化液在灭菌去离子水中，顺序加入氯化钠、氯化钾 、磷酸二氢钾 、十二水合磷酸氢二钠 、乙二胺四乙酸 、胰酶 、碳酸氢钠 ，使为 。完全溶解后过滤除菌，分装， 保存。犃 犆犜犃犅溶液含，氯化钠 ，乙二胺四乙酸 ， ， （配制方法为，在 水中顺序加入氯化钠 ，乙二胺四乙酸 ， 、浓盐酸 ，使 ，再加入，完全溶解后加水至 ） 。溶液使用之前加巯基乙醇至终浓度为 。犃 抽提液三氯甲烷异戊醇按 的比例混合，密闭避光保存。犃 抽提液 水溶液饱和的酚三氯甲烷异戊醇按 混合，密闭避光保存。犃 犃犕犞逆转录酶缓冲液（倍浓缩液）分别用 （ ） 、氯化钾 、氯化镁 、二硫苏糖醇 等体积混合， 保存。犌犅犜 犃 犜犪 狇酶缓冲液（ 倍浓缩液）分别用浓度为 的 （ ） 、 的氯化钾和的 水溶液等体积混匀配制而成， 保存。犃 犜犅犈电泳缓冲液（倍浓缩液）在 水中，分别加入 、硼酸 、乙二胺四乙酸 ，用 的盐酸调至 。犃 犈犅浓缩液用水配制成的浓缩液。用时每 电泳液或琼脂中加。犃 样品缓冲液每 水溶液中含溴酚蓝 ，蔗糖 。犃 包被稀释液（狆犎 ）在 水中，分别加入碳酸钠 、碳酸氢钠 ，充分搅拌完全溶解后，保存。犃 犿狅 犾犔犘犅犛（狆犎 ）在 水中，分别加入碳酸氢二钠 、碳酸二氢钠 、氯化钠 ，充分搅拌完全溶解后，保存。犃 犘犅犛犜洗涤液（狆犎 ）在 水中，分别加入氯化钠 、十二水合磷酸氢二钠 、磷酸二氢钾 、氯化钾 、吐温 ，充分搅拌完全溶解后，保存。犃 四甲基联苯胺储存液在 ， 二甲基甲酰胺中加入， ， 四甲基联苯胺（） ，充分搅拌完全溶解后，保存。犃 底物缓冲液（狆犎 ）在 蒸馏水中加入一水合柠檬酸 、十二水磷酸氢二钠 ，充分搅拌完全溶解后，犌犅犜 保存。犃 底物在 底物缓冲液中，分别加入四甲基联苯胺储存液 、 ，充分混匀后，现配现用。 犌犅犜 附录犅（规范性附录）犌犆犚犞扩增产物参考序列及其核酸 条带电泳图和细胞、犆犘犈形态本附录给出了扩增产物的参考序列，其中方框处为引物位置。同时给出了病毒核酸 条带的电泳图。同时给出了细胞正常图及其接种后所出现的。犅 犌犆犚犞 株第 条带（犛 ）的部分序列，犘犆犚扩增其中的 犫 狆片段。犅 犌犆犚犞 株第条带（犕）的部分序列，犘犆犚扩增其中的 犫 狆片段。 犌犅犜 犅 犌犆犚犞犎犅 株第条带（犔 ）的部分序列，犘犆犚扩增其中的 犫 狆片段。犅 正常的犆犗及其接种犌犆犚犞产生的犆犘犈形态图（见图犅 和图犅 ） 。图犅 正常的犆犗图犅 犆犗接种犌犆犚犞 株后出现的犆犘犈形态 犌犅犜 犅 犚犜 犘犆犚后的电泳图和犌犆犚犞核酸 条带的电泳图（见图犅 和图犅 ） 。说明：阴性对照； ： 株； ： 株； ： 株；：空白对照。图犅 犌犞犚犞经犘犆犚后的琼脂糖电泳图谱图犅 犌犆犚犞三种基因型毒株核酸犛犇犛 犘犃犌犈电泳图谱（由水科院珠江所提供） 犌犅犜 犌犅犜 ?、?“ ?”?：?，?。?。?、?“ ?”?：?犖，? 、 ? ?犖，?犖?。?、?“?” ：?犆（?）?犆 ?（ ，） ，?（ ，） 。?（ ）?。? ?，?，?，? ?。?， ?，?（，? ） 、?（，? ）?（ ，? ） 。?、?、?。?：?、?，?。? ?，?；? ? ?，?，?；? ? ?，?，? ?，? ?。犆 ?。?、?、?、?，?，?。犆 ?、?，?、?。?，?。?犌犅犜 ?，?，?、?。?“?” “?” “?”?。?。?（ ）?（ ）?，?；?（ ）?，?，?。犆 ? ?， ?，?。?，?。犌犅犜