研究生高级生化技术.pptx

实验二实验二 PCRPCR试剂盒检测试剂盒检测HBV DNAHBV DNA实验分组，认清试剂实验分组，认清试剂（每（每2人做一管，人做一管，2阳性管）阳性管）患者血清患者血清40 l+40 lDNA提取液，混匀提取液，混匀沸水浴沸水浴10min，10000rpm5min（离心机的使用）（离心机的使用）取上清取上清2 l（或阳性血清（或阳性血清2 l）加入一加入一PCR反应管反应管6000rpm5s，混匀，混匀一、实验操作及注意事项一、实验操作及注意事项933min预变性预变性(HemaPCR仪的使用与程序设计仪的使用与程序设计)9345s，5535s，7260s重复重复25个循环个循环72保温保温5min，-20保存备用保存备用二、二、二、二、PCRPCR基本原理及相关知识基本原理及相关知识基本原理及相关知识基本原理及相关知识n概念概念聚聚合合酶酶链链反反应应（polymerase chainreaction，PCR）是是一一种种体体外外扩扩增增特特异异DNA片片断断的的技技术术,能能在在短短时时间间内内获获得得数数百百万个特异万个特异DNA序列的拷贝。序列的拷贝。Kary MullisKary Mullisl PCRPCR技技术术最最早早由由美美国国 CetusCetus公公司司人人类类遗遗传传研研究究室室Kary Kary MullisMullis及及同同事事于于19851985年发现并研制成功的。年发现并研制成功的。lKary Kary MullisMullis因因发发明明了了“聚聚合合酶酶链链式式反反应应”而而获获得得19931993年年度度诺诺贝贝尔尔化化学学奖。奖。相相相相对对对对DNADNA克克克克隆隆隆隆而而而而言言言言，这这这这种种种种方方方方法法法法的的的的特特特特点点点点：操操操操作作作作简简简简便便便便、时时时时间间间间短短短短、特特特特异异异异性性性性高高高高、灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度高高高高、实用性强；实用性强；实用性强；实用性强；广广广广泛泛泛泛的的的的应应应应用用用用于于于于医医医医学学学学诊诊诊诊断断断断、分分分分子子子子生生生生物物物物学学学学、分分分分子子子子克克克克隆隆隆隆、基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断、法法法法医医医医学学学学、考考考考古古古古学学学学等等等等各各各各个领域。个领域。个领域。个领域。nPCR扩增扩增DNA片段的原理片段的原理 PCRPCR是是是是在在在在模模模模板板板板DNADNA、引引引引物物物物和和和和四四四四中中中中脱脱脱脱氧氧氧氧核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸等等等等存存存存在在在在的的的的情情情情况况况况下下下下，DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶依依依依赖赖赖赖的的的的酶酶酶酶促合成反应，整个扩增过程分三步：促合成反应，整个扩增过程分三步：促合成反应，整个扩增过程分三步：促合成反应，整个扩增过程分三步：变性：加热，模板变性：加热，模板变性：加热，模板变性：加热，模板DNADNADNADNA形成两条单链形成两条单链形成两条单链形成两条单链 退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链DNADNADNADNA与引物配对结合与引物配对结合与引物配对结合与引物配对结合 延延延延伸伸伸伸：在在在在DNADNADNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶及及及及镁镁镁镁离离离离子子子子等等等等存存存存在在在在的的的的条条条条件件件件下下下下，引引引引物物物物3-3-3-3-端端端端向向向向前前前前延延延延伸伸伸伸，合合合合成成成成与与与与模模模模板板板板配配配配对对对对的的的的新新新新链链链链 上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环DNADNA量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过环的模板，经过环的模板，经过环的模板，经过25-3025-30个循环后目的个循环后目的个循环后目的个循环后目的DNADNA就可就可就可就可以扩增以扩增以扩增以扩增10106 6101099倍。倍。倍。倍。通过循环可以提高通过循环可以提高通过循环可以提高通过循环可以提高PCRPCR的特异性。的特异性。的特异性。的特异性。n nPCR反应体系的组成及功能反应体系的组成及功能 PCR PCR PCR PCR的完成是在一个的完成是在一个的完成是在一个的完成是在一个0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml的的的的EPEPEPEP管中完成，一个完管中完成，一个完管中完成，一个完管中完成，一个完整的整的整的整的PCRPCRPCRPCR反应体系应包括以下成分反应体系应包括以下成分反应体系应包括以下成分反应体系应包括以下成分：模板模板模板模板 单、双链单、双链单、双链单、双链DNADNADNADNA均可。均可。均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNADNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNADNADNADNA结合结合结合结合蛋白类。蛋白类。蛋白类。蛋白类。相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCRPCR对对对对DNADNA模板纯度的要求并不严格。模板用量也是很低的，模板纯度的要求并不严格。模板用量也是很低的，模板纯度的要求并不严格。模板用量也是很低的，模板纯度的要求并不严格。模板用量也是很低的，一般认为一般认为一般认为一般认为102104102104拷贝模板就可以满足要求。拷贝模板就可以满足要求。拷贝模板就可以满足要求。拷贝模板就可以满足要求。一般一般一般一般100ng DNA100ng DNA100ng DNA100ng DNA模板模板模板模板/100/100/100/100 L L L L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。引物：是预扩增引物：是预扩增引物：是预扩增引物：是预扩增DNADNADNADNA片段两端的已知序列，是保证片段两端的已知序列，是保证片段两端的已知序列，是保证片段两端的已知序列，是保证 PCRPCRPCRPCR特异性的关键因素，特异性的关键因素，特异性的关键因素，特异性的关键因素，引物浓度：引物浓度：引物浓度：引物浓度：0.1-0.50.1-0.5 mol/Lmol/L浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。反应特异性下降。反应特异性下降。反应特异性下降。TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶有良好的热稳定性，具有有良好的热稳定性，具有有良好的热稳定性，具有有良好的热稳定性，具有5-35-3聚合酶活性和聚合酶活性和聚合酶活性和聚合酶活性和3-3-55外切酶活性，因此。它对核苷酸的错配是没外切酶活性，因此。它对核苷酸的错配是没外切酶活性，因此。它对核苷酸的错配是没外切酶活性，因此。它对核苷酸的错配是没有校正功能。有校正功能。有校正功能。有校正功能。其活性对其活性对其活性对其活性对MgMg2+2+浓度非常敏感浓度非常敏感浓度非常敏感浓度非常敏感终浓度一般为：终浓度一般为：终浓度一般为：终浓度一般为：2.5u/100ul2.5u/100ul，酶量增加使反应特酶量增加使反应特酶量增加使反应特酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量。异性下降；酶量过少影响反应产量。异性下降；酶量过少影响反应产量。异性下降；酶量过少影响反应产量。dNTPdNTP：已已已已 有有有有 商商商商 品品品品 化化化化 的的的的 混混混混 合合合合 液液液液，终终终终 浓浓浓浓 度度度度 一一一一 般般般般 为为为为20200umol/L20200umol/L。yy1010PCRPCR反应反应反应反应bufferbuffer：已作成商品化的产品，它包括：已作成商品化的产品，它包括：已作成商品化的产品，它包括：已作成商品化的产品，它包括：250500mmol/LKCl250500mmol/LKCl；100500mmol/LTris-HAC100500mmol/LTris-HAC（pH8.4pH8.4）；1520mmol/L1520mmol/LMgClMgCl2 2（对对对对TaqTaq酶酶酶酶的的的的活活活活性性性性影影影影响响响响很很很很大大大大，一一一一般般般般浓浓浓浓度度度度为为为为1.52.0mmol/L1.52.0mmol/L，实实实实际际际际应应应应用用用用时时时时根根根根据据据据反反反反应应应应体系的情况进行调整。）；体系的情况进行调整。）；体系的情况进行调整。）；体系的情况进行调整。）；0.1%0.1%明胶或牛血清白蛋白明胶或牛血清白蛋白明胶或牛血清白蛋白明胶或牛血清白蛋白ddH2O调节反应体积调节反应体积液体石蜡油液体石蜡油n影响影响PCR的主要因素的主要因素 PCRPCR反应体系的各个组分反应体系的各个组分反应体系的各个组分反应体系的各个组分 PCRPCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）PCRPCR循环的次数和平台效应循环的次数和平台效应循环的次数和平台效应循环的次数和平台效应 操作环境操作环境操作环境操作环境 平台效应及其原因 实验三实验三 核酸和蛋白紫外分光核酸和蛋白紫外分光光度法定量测定光度法定量测定分分光光光光度度技技术术是是利利用用物物质质特特有有的的吸吸收收光光谱谱对对其其进进行行定定性性、定定量量分分析析的的实验技术。实验技术。一、分光光度技术一、分光光度技术光学光谱区光学光谱区远紫外远紫外近紫外近紫外 可见可见近红外近红外中红外中红外 远红外远红外（真空紫外）（真空紫外）10nm200nm 200nm 380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m电磁波谱电磁波谱氢灯氢灯复合光复合光(阳光及钨灯阳光及钨灯)发射光谱发射光谱红红橙橙黄黄绿绿青青蓝蓝紫紫单色光单色光三棱镜三棱镜可见光分光光度计光源可见光分光光度计光源紫外分光光度计光源紫外分光光度计光源高高低低二、有关光学原理二、有关光学原理1.吸收光谱吸收光谱在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的溶液的吸收光谱吸收光谱。透射光透射光透射光透射光入射光入射光入射光入射光反射光反射光反射光反射光被被被被物物物物质质质质吸吸吸吸收收收收的的的的光光光光光吸收基本定律光吸收基本定律:Lambert-Beer定定律律A=lg(I0/It)=kbcItI0bdxI I-dIs朗伯定律朗伯定律(1760)(1760)A=lg(I0/It)=k1b比尔定律比尔定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c吸光度吸光度介质厚介质厚度度(cm)Lambert-Beer定律定律DKCL吸光度吸光度摩尔消光系数摩尔消光系数吸收物质的光径吸收物质的光径（cm）溶液浓度（溶液浓度（mol/L）722722型分光光度计结构方框图型分光光度计结构方框图光光源源吸收池吸收池检测系统检测系统分光分光系统系统利用分光光度法对物质进行定量测定的方法。利用分光光度法对物质进行定量测定的方法。（一）（一）标准曲线法标准曲线法（二）（二）标准管法标准管法三三.分光光度法在生物化学中的应用分光光度法在生物化学中的应用（一）（一）标准曲线法标准曲线法配置浓度递增的标准溶液（配置浓度递增的标准溶液（C），在最大吸收波），在最大吸收波长（长（max）处测得各个吸光度（）处测得各个吸光度（A），绘制标准曲），绘制标准曲线（线（A-C曲线）。曲线）。在测定被测样品时，以相同条件在在测定被测样品时，以相同条件在 max处测定处测定A值，从标准曲线上查得该样品相应的浓度。值，从标准曲线上查得该样品相应的浓度。分光光度法在生物化学中的应用分光光度法在生物化学中的应用01234mg/mlA。*0.80.60.40.20溶液浓度的测定溶液浓度的测定A bc工作曲线法工作曲线法(校准曲线校准曲线)朗伯朗伯-比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用（二）（二）标准管法标准管法在相同条件下测定已知浓度（在相同条件下测定已知浓度（C标标）标准溶液的吸光度）标准溶液的吸光度（A标标），同时测定未知浓度（），同时测定未知浓度（C样样）样品溶液的吸光度）样品溶液的吸光度（A样样），根据），根据Lambert-Beer定律：定律：A标标=K标标C标标L标标A样样=K样样C样样L样样分光光度法在生物化学中的应用分光光度法在生物化学中的应用样品与标准物质成分相同样品与标准物质成分相同K标标=K样样比色皿规格相同比色皿规格相同L标标=L样样/：A标标/A样样=C标标/C样样C样样=(A样样/A标标)C标标三三.分光光度法在生物化学中的应用分光光度法在生物化学中的应用紫外吸收法紫外吸收法原理：共轭双键原理：共轭双键优点：优点：简单、快速、灵敏、简单、快速、灵敏、样品可以回收样品可以回收缺点：缺点：有一定的误差（原因）；有一定的误差（原因）；受核酸类物质干扰受核酸类物质干扰结果分析：结果分析：浓度分析：浓度分析：光径光径1cm1cm，以溶解蛋白的缓冲液为对照，以溶解蛋白的缓冲液为对照A A280280=1.0=1.0对应蛋白质的浓度为对应蛋白质的浓度为1.0mg/ml 1.0mg/ml 蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/mlmg/ml）=1.45A=1.45A280280-0.74A-0.74A260260用分光光度计法定量用分光光度计法定量DNA1.取取2 l提提取取的的质质粒粒DNA，加加入入98 l蒸蒸馏馏水水对对待测待测DNA样品做样品做1:50(或更高倍数的稀释或更高倍数的稀释);2.蒸蒸馏馏水水作作为为空空白白,在在波波长长260nm、280nm处处调调节紫外分光光度计读数至零。节紫外分光光度计读数至零。3.加加入入DNA稀稀释释液液，测测定定260nm及及280nm的的吸吸收收值值。260nm读读数数用用于于计计算算样样品品中中核核酸酸的的浓浓度度，OD260值值为为1相相当当于于约约50 g/ml双双链链DNA，33 g/ml单单链链。可可 根根 据据 在在 260nm以以 及及 在在 280nm的的 读读 数数 的的 比比 值值（OD260/OD280）估估计计核核酸酸的的纯纯度度。一一般般DNA的的纯纯品品，其其比比值值为为1.8，低低于于此此值值说说明明有有蛋蛋白白质质或或其其它它杂质的污染。杂质的污染。4.记录记录OD值，通过计算确定值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公浓度或纯度，公式如下式如下:dsDNA=50(OD260)稀释倍数稀释倍数以上浓度单位为以上浓度单位为 g/ml