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ADVIA 2120 分析原理

基本原理
1 ． Flowcytometry 流式细胞学原理
待检样本在反应池中与试剂进行前处理，再经由仪器液路控制进入Flowcell(流动比色池)进行测定。
Flowcell测定的原理主要是应用特定的光源打在血球上产生散射，并利用设置在不同角度的信号探测器，探测光线散射和吸收的情况，经过信号分析运算就可以得到相关的血球特性资讯（如：体积，内容物浓度，密度），配合多个不同的Flowcytometry装置所收集足够的血球信息，就能够得到完整的血球计数以及分类的结果。

2.MIE光散射理论
MIE光散射理论：光线照射在颗粒上所造成之光散射强度测定公式如下
S = F（l，a，t，j，b）
S 散射光强度 l使用波长 a 折射率 t 容积 j 测量角度 b 形状因子

应用以上公式，固定其中几个因子，就可以测定出血球或者特定颗粒的折射率与体积

若将血球球形化，应用固定波长的光源，设置两个固定角度的光线探测器（高角度H，低角度L），带入这个公式：
SL = F1（l，a，t，jL，b）
SH = F2（l，a，t，jH，b）
分解这个方程式可以得到容积与折射率的计算方式：
容积a = f1（l，SL，SH ，jL，jH，b）
折射率t = f2（l，SL，SH ，jL，jH，b）
应用MIE光散射理论，将可测定出血球的体积（容积）与血球的内容物浓度（折射率）。

3.Cluster Analysis群组分析
当血球细胞经过Flowcell测定后，可得到血球细胞分布图（如下），如何通过统计学与电脑运算方式来界定各种类细胞，是血球分析仪是否准确的重要因素，其中：Cluster Analysis（群组分析）普遍应用在血球分析，此技术能精确的计算出如下数个群组的分界，不但定义出正常的细胞族群，对于异常细胞的出现也能提供敏感的讯息。

4.UFC(Uni-Fluidics Circuit) 集成流路系统
集成流路系统就是将传统血球记数仪中所应用的管路，反应池，控制阀，试剂运送，管路清洗等功能加以整合，利用UFC特殊材质的去极性及无变形的特性，增加仪器的稳定度与降低定期保养工作频率。

5．光源

应用最新科技的二极管激光发生器，具有光源稳定，体积小，寿命长的特性。

LASER SCATTER 激光散射测定
测定项目：RBC/PLT，BASO，RETIC

DARK FIELD OPTIC 卤素灯测定
测定项目：白血球分类

6．Flowcell 结构

1．Flowcell 2.shuttle Nipple 3.Sample Nipple 4.Sheath Nipple
5.Optics Lens 6.Mirror 7.Low angle detector 8.Hi angle detector
9.light source
Flowcell运作原理：
鞘液经由Sheath Nipple进入Flowcell形成一稳定介质，再将处理过的细胞（稀释，染色或球形化）经由Sample Nipple以稳定的流速注入Flowcell，当细胞通过光源时会因不同的细胞特征（体积，染色程度，血红素浓度或核密度）产生不同程度的散射，再由Flowcell后方两个探测器（高角/低角）测定光线变化，两个探测器所收集到的信号加以分析计算，就可以得到所需要的细胞特征。

7.RBC/PLT反应测定原理
测定项目：红细胞计数与形态分析
反应：稀释，球形化，固定
全血样本2ul与RBC/PLT稀释液1250ul混合，形成625倍稀释，此步反应主要是将红细胞形态改变，由原来的“双凹圆盘型”改变为‘球形’即球形化，试剂中含有固定剂可以使改变形态的红细胞保持稳定，以利于光学法测定细胞体积与血红素浓度。

MIE光散射理论的应用
血液经前处理后，样本中所含的红细胞，血小板等均呈圆球状，经由流体力学的控制，血球可以依序进入Flowcell，并通过激光照射后出现不同的光散射，利用高/低角度探测器分别测量在此两角度的吸光度变化，就可以测定出细胞的物理特性：如细胞体积，内容物浓度，血红素浓度等参数。

MIE MAP

MAP直交展开
红细胞分布图（九分图）

1. 60fl 2. 120fl 3. 28g/dl 4. 41g/dl
红细胞分布图相对位置

红细胞碎片 2.高色素红细胞3.红细胞4.血小板

1.小红血球阈值 2.大红血球阈值 3.低血色素阈值 4．高血色素阈值

血小板分布图相对位置

1.血小板 2.大血小板 3.红细胞
4.红细胞碎片 5.噪音 6.红细胞阴影

8．BASO通道测量原理
主要反应：破坏红血球，血小板，白细胞裸核化

全血样本12ul与BASO稀释液500ul混合，形成41.6倍稀释, BASO稀释液为强酸性溶液可将样本中红细胞，血小板，以及嗜碱细胞(保持原态)以外的所有白细胞（裸核化）加以破坏，在经由流体控制将嗜碱细胞及裸核化的白细胞送入Flowcell,当血球经过激光照射后，应用MIE理论，测定高/低角度信号变化，就可以得出细胞体积与核密度。
MIE光散射理论之应用

如上图，为BASO通道细胞处理后示意图，低角度散射光变化可以测出细胞体积，高角度光为核密度，形成右下角的细胞分布图，其中，嗜碱细胞因为保留完整的细胞膜。体积相较之下比其他白细胞的裸核大，因此分布在细胞分布图的上方，其余的裸核则聚集在细胞分布图的下半部分，且依照其细胞核的核密度分布，越靠近X轴左边表示核密度低或者单核，越靠近X轴右边表示核密度高或者多核。

单个核白细胞分布在左半区，包含：Monocyte,Lymphocyte,
多个核白细胞分布在右半区，包含：Eosinophil,Neutrophil,NRBC
利用单核细胞与多核细胞的分布就可以算出Lobularity Index,如图所示，此Index为以前判断是否左移的主要依据

BASO通道细胞分布图（正常状态）

1.噪音 2.原始细胞 3.MN（单核） 4.Basophile嗜碱5.Baso-Suspect可疑嗜碱 6.饱和区 7.PMN（多核）8.NRBC（有核红细胞）

BASO（PMN/MN）不能清楚分辨时，将出现以下分布图

1．噪音2. 原始细胞 3.MN（单核）4.Basophile嗜碱5.Baso-Suspect可疑嗜碱 6.饱和区7.PMN（多核） A. Noise/Baso阈值 B. 原始细胞阈值 C. MN/PMN阈值 D.BASO/裸核阈值 E. BASO/ 饱和阈值

9.Retic
反应：红细胞球形化及RNA染色
全血样本2ul加入auto retic试剂1250ul混合
试剂中含有RNA染剂Oxazine750,可渗透至网织红细胞细胞膜内，将细胞质内的RNA加以染色，细胞质内含有RNA的网织红细胞将被染成蓝色，且依照RNA含量的多少反应染色的程度，细胞膜内不含RNA的红细胞与血小板则不被染色。
网织红细胞的成熟过程：Heilmeyer成熟度分期
网织红细胞成熟过程的分期主要以活体染色后，RNA染色的形态及RNA含量作为分类依据，以下为网织红细胞的分期与存在位置。
O Type:具有染色颗粒与细胞核的有核红细胞
I-IV Type:具有RNA染色颗粒的无核红细胞。

MIE光散色理论应用：计算细胞数量及特性分析
利用RBC/PLT Channel的光学系统，当细胞通过激光产生散射，再利用信号探测器测量各角度散射光强度，应用MIE原理计算：低角度散射光可测定出细胞体积，高角度散射光可测定细胞血红素浓度，吸光度变化的测量可以计算出RNA染色浓度，利用以上三个测定植就可以得到完整的网织红细胞分析。
网织红细胞分布图

Retic/PLT阈值2.同时通过细胞阈值 3.Retic/Mature RBC阈值 4. Low/Med阈值5.Med/High阈值A.成熟红细胞B.低吸光ReticC. 中吸光ReticD. 高吸光ReticE. PLT/Retic阈值F. 同时通过细胞
每颗网织红细胞所含的Hgb含量计算公式：
MCH(pg)=MCV(fl)*MCHC(g/dl)/100

10.PEROX白细胞分类（过氧化酶染色）
反应：破坏红细胞，加热固定白细胞，过氧化酶染色
第一步骤：全血样本12ul加入250ul Perox 1,反应池加热到70度进行红细胞破坏之反应及
第二步骤 用Perox 1中甲醛固化WBC及包膜皱缩。（17 秒）
第三步骤：同时加入125ul Perox 2，主要成分为4Chrolo-1Naphol之呈色剂，及250ul Perox 3，主要成分为H2O2，为过氧化酶反应中的底物，释放出O与呈色剂反应，在胞浆中产生黑色沉淀.
（13秒）

H2O +4Chrolo-1Naphol --- 过氧化酶细胞--------à细胞内黑色沉淀

测定：染色后的白细胞利用光学法测定染色程度，细胞体积，细胞数量
白细胞过氧化酶活性：

Eosinophil:4+ ，Neutrophil:2+to3+， Monocyte: weak+
Lymphocyte: negative Basophil: negative
染色后的白细胞通过Flowcell时，透过卤素灯为光源的白色光照射将造成不同程度的光线散射，利用Flowcell后方的两个探测器探测散射光的强弱，即可测定出白细胞的体积。染色程度，组成过氧化酶染色的细胞分布图
Peroxidase Cytograme 细胞分布图

1噪音（红细胞，血小板碎片）2.有核红细胞3.血小板凝集4.淋巴+嗜碱5.LUC6.单核7.中性8.嗜酸

11.Hgb血红素
反应：氰化血红素比色法
全血样本2ul加入500ul Hgb稀释液，主要成分为KCN及表面活性剂，可以将样本中的红细胞破坏，红细胞中的血红素与KCN反映呈色后，测定透光度的变化，再以鞘液的透光度作为背景值，利用透光度和背景值的差值就可以计算出样本中血红素的浓度。
测定光源波长：546nm

前一样本2.样本与试剂打入反应池3.血红素透光度测定
4.反应池清洗5. 鞘液透光度测定

12，Mophology Flag 判定标准
1．ANISOCYTOSIS (ANISO)
+ RDW = 16.0 % to 17.9 %
++ RDW = 18.0 % to 22.0 %
+++ RDW > 22.0 %

2．MICROCYTOSIS (MICRO)
+ %MICRO = 2.5 % to 6.4 %
++ %MICRO = 6.5 % to 10.5 %
+++ %MICRO > 10.5 %

3．MACROCYTOSIS (MACRO)
+ %MACRO = 2.5 % to 6.4 %
++ %MACRO = 6.5 % to 10.5 %
+++ %MACRO > 10.5 %

HGB CONCENTRATION VARIANCE (HCVAR)
+ HDW = 3.4 g/dL to 3.9 g/dL
++ HDW = 4.0 g/dL to 4.5 g/dL
+++ HDW > 4.5 g/dL

HYPOCHROMIA (HYPO)
+ %HYPO = 4.0 % to 7.9 %
++ %HYPO = 8.0 % to 12.0 %
+++ %HYPO > 12.0 %

HYPERCHROMIA (HYPER)
+ %HYPER = 4.0 % to 7.9 %
++ %HYPER = 8.0 % to 12.0 %
+++ %HYPER > 12.0 %

ATYPICAL LYMPHOCYTES (ATYP)
+ %LUC = 4.7% to 7.4%
++ %LUC = 7.5% to 10.0%
+++ %LUC > 10.0%

LEFT SHIFT (LS)
This flag is triggered if BASO d/D is less than 0.15.
This flag is not triggered if %NEUT is less than 30 %.

+ LI > 1.9
++ LI = 1.7 to 1.9
+++ LI < 1.7

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