NY∕T 2729-2015 李属坏死环斑病毒检测规程(农业).pdf

ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 2729一2015李属坏死环斑病毒检测规程Criterion for prunus necrotic ringspot virus detection 2015-05-21发布2015-08-01实施中华人民共和国农业部发布削昌本标准按照GBjT 1. 1-2009给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出并归口。NY/T 2729-2015 本标准起草单位:农业部花卉产品质量监督检验测试中心(昆明人云南省农业科学院花卉研究所、国家观赏园艺工程技术研究中心、云南省花卉育种重点实验室、云南省花卉工程技术研究中心。本标准起草人:王丽花、瞿素萍、王继华、杨秀梅、吴学尉、王其刚、张艺萍、张丽芳、苏艳、彭绿春。I NY/T 2729-2015 李属坏死环斑病毒检测规程1 范围本标准规定了李属坏死环斑病毒(Prunusnecrotic ringspot virus PNRSV)的双抗体夹心酶联免疫吸附检测法(DAS-ELISA)和指示植物检测法。本标准适用于植物组织中李属坏死环斑病毒的检测。2 取样根据样品属性，取发芽幼苗、腋芽、枝条韧皮部、果实表皮、叶片、鳞片外表皮等器官或组织，洁净水洗净后备用。3 检测方法3. 1 双抗体夹心酶联免瘦吸附测定法(DAS-ELISA)3. 1. 1 原理利用抗原(病毒)与其特异性抗体在离体条件下产生专性反应的原理。即存在于样品中的病毒颗粒首先被吸附在酶联板孔中的单克隆抗体捕捉后，再与碱性磷酸醋酶标二抗结合反应，后加入碱性磷酸酶底物，酶将底物水解并产生有色产物。颜色的深浅与样品中病毒的含量成正比，若样品不携带病毒则无颜色反应。3. 1. 2 仪器、用具及耗材酶标仪(配405nm滤光片).恒温培养箱(温度可调范围O.C40.C).生物培养箱(具光照、温度可调范围OOC500C)，电子天平(感量为0.01g、0.0001 g)，酸度计。微量移液器(200Ll000L. 10L100L，0.5L10L)，酶联板，研钵或自封袋，微量移液器吸头，离心管等。3. 1.3试剂3.1.3.1 所用试剂均为分析纯，水为蒸馆水。3.1.3.2 抗体和对照PNRSV抗体、阳性对照、阴性对照或DAS-ELISA检测试剂盒均未自市售。3.1.3.3 包被缓冲液(pH9. 6，贮藏于40C)碳酸纳(Na2C03) 1. 59 g 碳酸氢铀(NaHC03)2. 93 g 叠氮化纳(NaN3)0.2 g 加蒸馆水溶解定容至1000mL. 3.1.3.4 洗涤缓冲液(PBST，pH7. 4) 氯化纳(NaCl)8.0 g 无水磷酸二氢悍(KH2P04)0.2g 无水磷酸氢二铀(Na2HP04) 1. 15 g 氧化伺(KCl)0.2 g 吐温20(Tween-20) 0.5 g 加蒸馆水洛解定容至1000mL。3. 1.3.5 样晶提取缓冲液(GEB，pH7.4，贮藏于40C)1 NY/T 2729-2015 脱脂奶粉2.0 g 聚乙烯口比咯皖酣(PVP,MW 24川0000)20.0 g 元水亚硫酸铀(Na2S03)1. 3 g 叠氮化铀(NaN3)0.2 g 吐温一20(Tween-20)20.0 g 溶于PBST中，定容至1000mLo 3. 1.3.6 酶标抗体稀释缓冲液ECl,pH 7. 4，贮藏于40C牛血清白蛋白(BSA)2.0 g 聚乙烯口比咯皖酣(PVP,MW 24川0000) 叠氮化铀(NaN3) 溶于PBST中，定容至1000mL。3.1.3.7 底物缓冲液PNP，pH9. 8，贮藏于40C二乙醇胶六水氯化模(MgC12 6H20) 20.0 g 0.2 g 97.0 mL 0.1 g NaN3 0.2 g 溶于800mL蒸馆水中，用2mol/L盐酸调pH至9.8，定容至1000mL。3. 1.3.8 底物溶液(现用现配)根据需要称取对硝基苯磷酸二铀(PNPP)溶于底物缓冲液中配制成1mg/mL的底物溶液。3. 1.3.9 终止液3moi/L氢氧化饷溶液)称取120gNaOH，溶于1000mL蒸馆水中o3. 1.4 操作步骤3. 1.4. 1 包被抗体在酶标板孔中加人100L用包被缓冲液按工作浓度稀释好的抗体，将酶标板用保鲜膜包好放入湿盒中，置于40C冰箱内孵育过夜或室温(200C250C)下孵育4ho 3. 1.4.2 试样制备将待测试样和GEB按1: 10(g/mL)的比例放入研钵或二三0.2mm的加厚自封小塑料袋中磨碎至匀浆，后转入离心管800r/ min 1 OOOr/ min离心2min，获得上清液。阳性对照、阴性对照的上清液制备同上，阳性样品为己知的携带PNRSV的材料或试剂盒提供的阳性对照;阴性样品为己知的不携带PNRSV的材料或试剂盒提供的阴性对照。3. 1.4.3 洗板孵育结束后，将孔内液快速倒出，每孔加满PBST清洗酶标板，清洗4次6次，每次停留1min 2min。清洗完成后在洁净吸水纸上拍出孔内残液。3. 1. 4. 4 包被试样吸取3.1. 4.2的上清液加入清洗完成后的酶标板，每孔加100L.每个待测样品设置重复，同时设阳性对照、空白对照和阴性对照。将酶标板用保鲜膜包好放入温盒中，40C冰箱内孵育过夜或210C240C下孵育2.0 h2. 5 h。3. 1. 4. 5 洗板同3.1. 4. 30 3. 1. 4. 6 包被酶标抗体包被前按酶标抗体稀释比例在干净玻璃管或聚乙烯管中加人定体积的EC1和酶标抗体充分混匀，酶标板每孔加100L，完成后将酶标板用保鲜膜包好放人湿盒，210C240C下孵育2.0 h2. 5 h。3. 1.4.7 洗板NY/T 2729-2015 同3.1.4.303.1.4.8 加底物溶液每孔加入100L配制好的底物溶液。酶标板用保鲜膜包好放人湿盒中21oc 24 oc下敲光显色30min60min。显色达到要求后，每孔加人50L终止液终止反应。3. 1.4.9 酶标仪读数终止反应20min内，将酶标板置于酶标仪中，在405nm波长下测量吸光度值(004川，并记录结果。3. 1.5 结果判断3. 1. 5. 1 检测结果有效性判断当肉眼看阳性对照显色、空白对照和阴性对照元色，重复测定值的精密度自20%时，判为有效检测结果;否则视之为无效检测结果，需重新检测。自=IOD削度值)。3. 1.5.2 检测结果判断试样平均00405值/阴性对照平均00405值二三2时，判为阳性。试样平均0040，1值/阴性对照平均00405值运1.5时，判为阴性。试样平均00405值/阴性对照平均00405值在1.52之间，判为可疑试样，需重新检测-次，或用其他方法进步确认。3.1.5.3 若为商品试剂盒，根据试剂盒说明进行判断。3. 2 指示植物法3. 2. 1 原理在专用隔离温室条件下，利用对病毒敏感的寄主植物(指示植物)上产生明显特征症状来诊断病毒种类的方法。即用感病的植物叶片与少许金刚砂混合，研磨成粗汁液，然后蘸取汁液摩擦供试植物叶片，经蒸馆水清洗后，置于隔离温室内观察症状表现。3.2.2 接种缓冲液称取O.252 g Na2 S03溶于预先配制好的O.01 mol/L PBS缓冲液(称取0.8g氯化纳，0.02g氧化饵，0.115g七水磷酸氢二锅，0.019g无水磷酸二氢梆溶于蒸馆水中，定容至100mL)，定容至100mL。3. 2. 3 栽植指示植物每检测样品的指示植物栽植数量注5株。于专用隔离温室，将健康种子播种于经过消毒的富含有机质士壤的花盆中，盆间距50cmX50 cm，待有4真叶6真叶后准备接种。栽植环境条件为温度为200C250C ，光照时数为12h。3.2.4 摩擦接种将待测样品按1: 3(g/mU的比例与接种缓冲液?昆合研磨，用细纱布过滤匀浆液，在1000 g 10000 g下离心10min 15 min后取上清液。接种时，在3.2. 3准备的指示植物叶面撒少量600日金刚砂，用研磨棒蘸取上清液轻轻摩擦接种叶片。接种后，用蒸馆水冲洗被接种叶片上的残留汁液。每株指示植物接种2个3个叶片且只接种一个样品，并设阳性对照(带毒植株)、阴性对照(健康植株)和空白对照(接种缓冲液)。3. 2. 5 记录接种后20d内，每日观察、记录指示植物症状。3. 2. 6 结果判断接种5d18 d后发病，根据表1指示植物症状，确定病毒携带情况。在所有接种的指示植物中只要有一株表现典型症状，该样品即为阳性。3 NY/T 2729-2015 表1鉴别寄主症状指示植物症状中文名拉丁学名黄瓜Cucumis sativu 接种后4d5 d子叶产生扩散性褪绿斑，第6d第18d 出现顶枯现象毛樱桃Prunus tmenlosa 接种后5d 18 d幼苗叶片上产生环斑或弧形斑，后生长萎陷和死亡山樱花Prunus serrulata 接种后5d 10 d芽局部性坏死、流胶昆诺黎Chelloodium quinoa 接种后5d6 d产生局部或系统褪绿环斑，或灰色坏死斑，心叶畸形4 判定检测结果为阳性即可判断为待测试样携带李属坏死环斑病毒。4