李斯特菌2013.7.8-7.14.doc

李斯特菌(第一周7.8-7.14)
10动物科学 2010084523 邱杰英
家畜和人感染此菌后，表现为脑膜炎、败血症和孕畜流产；家禽及啮齿动物表现为坏死性肝炎和心肌炎。
一、 概况：
李斯特氏菌是一种格兰氏阳性菌，形状为圆尾带柱，它是一种非芽孢兼性厌氧菌。
李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。
目前国际上公认的李斯特菌共有七个菌株：
单核细胞增生李斯特(L.monocytohenes)
绵羊李斯特菌 (L.iuanuii)
英诺克李斯特菌 (L.innocua)
威尔斯李斯特菌 (L.welshimeri)
西尔李斯特菌 (L.seeligeri)
格氏李斯特菌 (L.grayi)
默氏李斯特菌 (L.murrayi)
其中单增李斯特菌是主要能引起人类疾病的菌。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。
二、 李斯特菌的来源

１、 人
　　首先，人能传播这种感染。特别是在医院里，通过人和人的接触尤易感染。据报道，健康人群粪便中lm的携带率为0.6－16%，有70％的人可短期带菌。据有关研究表明，大约有５％到１０％的健康人群携带有这个病菌。
２、 动物及环境
　　李斯特菌传播给人类的主要途径是通过水源到厨房的食物链中的任何一个环节。它既能随食品原料进入食品加工厂，也可由灰尘或排泄物经工作人员带入，污染工作场所机机械设备，进而污染食品。直接或间接的接触动物，都有可能成为感染李斯特菌的来源。牛和羊类都能成为李斯特菌的携菌体。从环境方面来说，李斯特菌（Ｌｍ）也广泛地存在于环境中。因此，食品从环境当中受到李斯特菌（Ｌｍ）的机会是很大的。从食品工厂来说，在后处理阶段，特别重要的是防止从工厂设施和机器中受到污染。
３、 食品
　　食品能在食品链中的任何一个环节受到李斯特菌（Ｌｍ）的污染，包括从原产地，到工厂的加工过程，进入分销环节，直致进入消费者的厨房。这个情况在那些潮湿气候的地区尤为显著。前已述及，李斯特菌可以在许多食品中得到感染，如牛奶、乳酪、生家禽和家畜肉、发酵香肠、蔬菜和海产品（4－8%）。当然，有些食品被检出其它类型的非Ｌｍ李斯特菌，可能不会引起人的感染，然而，其存在的事实勿庸置疑表明：操作过程的卫生状况需要立即加以改进。我们特别要注意，对于那些操作温度较高，保质期较短且常在冷藏条件下保存的食品通常都是李斯特菌的适宜生长环境。
三、控制因素
李斯特菌的感染最近呈上升趋势，在美国，１９６７－１９６９报告有２５５个感染例，然而，在１９８７年，这个数字却达到了１５００。要想区分哪些李斯特菌的感染是来源于食品，或者说，分别区分出来源于食品或非食品，却是很困难的。原因是它有很长的潜伏期。根据记载，第一例确定由食品引起的李斯特菌感染在１９８１年，发生在加拿大的一次沙拉制品的较大规模的污染事件。在那次事件中，有４１例被感染，７例致死。根据调查，原因是其中的卷心菜受到了李斯特菌的污染。污染源又是通过做为肥料的羊粪而来。这些羊被怀疑感染了李斯特菌。其后，在美国、瑞士、英国、法国又相继发生了李斯特菌的污染事件。牵涉到的食品有牛奶、乳酪、猪肉、生乳制品等。因此,有效的控制和预防被提到了一个及其重要的位置。以下，列举一些重要的控制因素。
１、 温度
　　李斯特菌Ｌｍ是在能引起食品传染的致病菌中的比较特殊的一种。其原因是它属适冷细菌，李斯特菌能在2.5～42℃的温度下生存(有的资料讲在０～４４℃温度条件下能生长)，以４～６℃时繁殖最快。李斯特菌Ｌｍ能在冷冻产品中存活至几个星期，在酸性条件下较为困难。
２、 抗热性
　　李斯特菌Ｌｍ不是一种特别的抗热菌种，它不是芽孢菌，因此可以在巴氏灭菌的条件下被破坏。然而，相比较另一些食品致病菌，它的抗热性要好一些。根据实验，一套良好的灭菌乳系统能将生乳的Ｌｍ控制在正常单位以下。对于肉制品而言，至少要保证７０℃和２分钟以上的加热时间。如果加热过程不稳定，则可能减低杀菌效果。
３、ＰＨ
　　同其它细菌一样，李斯特菌在酸性条件下的存活能力取决于酸的种类和温度。通常能在ＰＨ小于５的条件下得以生长，其中，李斯特菌得以生长的最低的ＰＨ值据记录是在ＰＨ４．３。在冷藏条件下，它能生长的最低ＰＨ值线有所提高，据研究表明在ＰＨ５．２。
４、水分活性及盐
　　李斯特菌Ｌｍ单是一种能承受高离子浓度和低水分活性的菌种。它能够在１０％的ＮＡＣＬ溶液内甚至更高的浓度下得以存活甚至生长；同时，也能在水分活性０．９２的条件下生长。其最低限随温度及溶剂的不同而稍有差异。
备注:水分活性AW来表示。其定义为食品所显示的水蒸汽压P对在同一温度下纯水的蒸汽压P0之比:
Aw=P / Po
水分子会从水中蒸发跑到空气中成为气体，即水蒸汽，而气体都有一定压力，水蒸汽的压力就称为水蒸汽压，一般食品不仅含有水，而且含有蛋白质，淀粉等固形物，所以它的水相对地就比纯水少，故其水蒸汽压也就小，即一般有P＜P0，所以AW值皆小于1。
５、 空气
　　在微生物实验中，用肉汤培养基显示厌氧培养有助于Ｌｍ的生长。同时，另一些实验表明在缺氧状态下，Ｌｍ能在３℃到７℃的条件下在肉类中繁殖。同样，在３－１０％的充二氧化碳的条件下，Ｌｍ能在５℃的条件下在不同种的蔬菜中得以生长。然而，高浓度的二氧化碳（８０％）能抑制。
四、 杀灭条件
该菌对理化因素抵抗力较强60－70℃经5－20min可杀死，70％酒精5min，2.5％石炭酸（氢氧化钠，福尔马林）20min可杀死此菌。该菌对青霉素，四环素，磺胺均敏感。
五、 监控频率
对加工环境
较湿的应每周检测一次，
较干的需每月监控一次。
若监控环境的检测结果不理想,则返回监控在一定时间内生产的产品,检测产品是否受到影响.
六、 检验方法：
（一） 国标法 (常规法)
1、增菌培养
　　取回的样品应在4℃下处理、存放和运送，如果是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。
　　取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h和44h.。
2、 分离
　　共培养24h和48h后，取EB培养物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3+LPM琼脂平板上划线。PALCAM琼脂可替代LPM琼脂。将OXA和PALCAM平板置于35℃培养24-48h，LPM平板在30℃培养24-48h。然后，把LPM平板放于解剖镜载物台上，以450角入射光从平板下面照射平板，通过目镜垂直向下观察寻找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光泽的兰色或灰色。用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对照
加入七叶苷和Fe3+的LPM平板不用斜射光系统，选择可疑菌落的方法与在OXA上选择可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周围有一个黑色环，其它菌也可形成黑色环，但形成时间要在两天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似
在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。食品检验中在TSAYE平板上纯化是必须的，因为在PALCAM和OXA或LPM平板上分离菌落时可能沾有不可见的受抑微生物。挑取5个典型菌落的原因是一个样品中可能分离到一种以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培养24-48h，如果不用于动力观察，也可在35℃培养。
4、李斯特氏菌属的区别
　　将TSBYE肉汤培养物接种到3mLTSBYE肉汤中，35℃培养24h，接种2支TSAYE琼脂斜面，35℃培养24h。用3mL0.01mol/l磷酸盐缓冲液将斜面菌苔洗下，菌悬液于80℃水浴中加热1h，以2500r/min离心30，弃去2mL上清夜，将剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。
5、小鼠毒力试验
　　将分离的菌株接种到10 mL TSBYE肉汤中，35℃培养24h，将培养物离心、浓缩，用1mL生理盐水制成菌悬液（浓度为1010个菌/mL），取0.1mL腹腔注射体重为16-18g 小鼠，每组5个观察7d内小鼠死亡情况。用已知致病的单增李斯特氏菌和非致病的英诺克李斯特氏菌相同方法进行，做对照试验。
6、协同溶血（CAMP）试验
　　在羊血琼脂平板上平行接种β-溶血金黄色葡萄球菌（S.aureus）和马红球菌(R.equi),在它们中间垂直划线接种可疑菌，与两线相近但不相交，在30℃培养24h-48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，绵羊李斯特氏菌在马红血球附近的溶血增强。
(二) 免疫学检测方法
1、 自动酶联荧光免疫检测系统（VIDAS） 分析方法
自动酶联荧光免疫检测系统（VIDAS）分析方法是对李斯特菌属全部种的筛检，VIDAS LMO则是对李斯特菌属中主要致病菌－单增李斯特菌的筛检。