重点与难点剖析第九章微生物的遗传.doc

第九章 微生物遗传
重点与难点剖析

一．遗传的物质基础
1．转化实验
1928, Griffith
RII + SIII(加热杀死) ® 小鼠死 ® 血液中分离出SIII
1944, Avery等 证明只有SIII的DNA才能将RII转化为SIII, DNA是遗传物质.
RII + SIII的DNA SIII型细菌
SIII的DNA+除DNA酶以外的酶
SIII的DNA+DNA酶
SIII的RNA
RII型细菌 RII型细菌
SIII的蛋白质
SIII的荚膜多糖
2．噬菌体感染实验
1952年Hershey 证明T2噬菌体的DNA含有整套遗传信息
3．烟草花叶病毒拆分实验烟草花叶病毒拆分实验
1956年Fraenkel-Conrat 烟草花叶病毒拆分实验证明RNA是遗传物质

二．微生物的基因组
基因组（genome）：
一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称.细胞或病毒中的所有基因以及非基因的DNA序列的总称, 包括结构基因,调控序列,功能目前尚不清楚的DNA序列.
基因：编码多肽、rRNA和tRNA的多核苷酸序列。

细菌、真核生物、古生菌基因组主要特点比较：

染色体特点
遗传信息连续性
操纵子结构
结构基因拷贝数/重复序列
负责信息传递功能的基因（复制、转录、翻译）
细菌
Escherichia coli 的基因组
染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）
一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的
大量存在
单拷贝
重复序列少而短
细菌类
真核
Saccharomyces cerevisiae (酿酒酵母)的基因组
典型的真核染色体结构
有间隔区（即非编码区）和内含子序列，断裂基因
没有明显的操纵子结构
高度重复
真核生物类
古生菌Methanococcus jannaschii (詹氏甲烷球菌)的基因组
染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；
另外有有5个组蛋白基因，暗示其染色体结构类似与真核生物
同细菌
同细菌
同细菌
类似于真核生物

三．质粒
质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。

1．质粒的分子结构：通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；（细菌质粒多在10kb以内）

2．质粒的检测：
l 提取所有胞内DNA后电镜观察；
l 超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；
l 对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。
对于由于三种构型同时存在时造成的多带现象（提取质粒时造成或自然存在），可以进行特异性单酶切，使其成为一条带。

3．质粒的主要类型
质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，
从而使宿主得到生长优势。
质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应:
致育因子（Fertility factor，F因子）
抗性因子（Resistance factor，R因子，抗药、抗重金属 ）
产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）
毒性质粒（virulence plasmid）
代谢质粒（Metabolic plasmid）
隐秘质粒（cryptic plasmid）

高拷贝数(high copy number)质粒（每个宿主细胞中可以有10-100个拷贝）----松弛型质粒(relaxed plasmid)
低拷贝数(low copy number)质粒（每个宿主细胞中可以有1-4个拷贝）--— 严谨型质粒(stringent plasmid)

窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）
广宿主范围质粒(broad host range plasmid)（可以在许多种细菌中复制）

4．质粒的不亲和性
某些质粒可以在同一个细菌中并存，能并存的质粒属于不同的不亲和群（亲和现象），不能并存的质粒属于同一不亲和群（不亲和现象）。

四、转座因子
转座因子（transposable element）：位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。
遗传学效应
① 插入突变（无义，有义）；
② 导致染色体畸变（不同位置上的2个转座因子发生同源重组，导致的染色体DNA缺失、倒位）；
③ 基因移动和重排。
原核生物中的 3类 : IS（insertion sequence）;Tn转座子（transposon）; 特殊病毒
1．IS
最简单的转座因子，250-1600bp，只含有转座所必须的转座酶基因，分布在细菌的染色体、质粒和某些噬菌体DNA上。引起无义突变，可以回复。
IR（inverted terminal repeat）
2．Tn转座子
授予宿主某些遗传特性的基因，如抗生素，抗毒物基因，乳糖发酵基因等。
2种类型 ①复合转座子，2端为顺向或反向的IS，其他基因位于中部， Tn5
②复杂转座子，2端为IR（30-50bp），其他基因位于中部，Tn3
整合子(integrons) 是存在于细菌中可移动的基因捕获和表达的遗传单位,通过转座子或质粒在细菌中传播遗传物质。
大多数细菌的耐药性都是由于获得外源耐药基因而引起的.近年来,国外学者通过大量实验证明,整合子是细菌,尤其是革兰阴性杆菌多重耐药性迅速发展的主要原因。
3．特殊病毒 Mu-噬菌体
E．coli 的温和噬菌体，可以溶源化，也可裂解生长，含有噬菌体生长繁殖的必需基因，同时含有转座所必须的基因，因此是目前发现的最大转座因子。全长39kb，2端无反向重复序列。

五．基因突变

突变：可以通过复制遗传的DNA结构的任何改变.
2类 : 基因突变: 1个基因内部DNA结构的任何变化
染色体畸变: 大片段DNA的缺失、重复和倒位.
DNA结构的任何改变可以通过DNA复制而成为真正的突变，也可以重新变为原来的结构，这取决于修复作用和其它多种因素。

1．基因突变类型及其分离

密码子: 3个碱基对应1个氨基酸,是生物内负载遗传信息的基本单位.
特点: ① 三联体密码子; ② 简并性 4种碱基® 64个三联体密码( 3个终止密码 , UGA, UAG, UAA, 61个密码子, 20氨基酸); ③ 非重叠性
碱基改变与基因突变: 同义突变, 无义突变, 移码突变, 错义突变 统一图

表型变化及其分离
表型: 可以观察、检测到的个体性状或特征，是基因型在一定环境条件下的表现。
基因型：DNA的碱基顺序

几种常用的表型变化的突变型及其分离: 营养缺陷型;抗药性突变型;条件致死突变型;其他突变型.
① 营养缺陷型（auxotroph）
一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能生长。
表型判断的标准：在基础培养基上不能生长(负选择标记)
影印平板（Replica plating）法: Lederberg在1952年建立
营养缺陷型的表示方法：在具体使用时多用 hisC¯ 和 hisC+ ，分别表示缺陷型和野生型
② 抗药性突变型（resistant mutant）
基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。
特点：正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）
表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示, strr 和strs 分别表示对链霉素的抗性和敏感性
③ 条件致死突变型（conditional lethal mutant）
在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。
常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts（temperaturesensitive）表示，这类突变在高温下（如42℃）是致死的，但可以在低温（如25-30℃）下得到这种突变。(负选择标记)
影印平板法分离, 和营养缺陷型不同的是培养基, 完全培养基
④ 其它突变类型: 形态, 菌落形态、颜色、噬菌斑形成，etc.
非选择性突变, 突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。

2．基因突变的分子基础
突变
自发突变 环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为10-6-10-9 。
诱变 某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。
(1). 自发突变
特点:非对应性(自发性，随机性); 稀有性; 规律性; 独立性; 遗传和回复性; 可诱变性
突变率：每单位群体繁殖一代形成突变体的数目。如突变率为1×10-8，既意味着当108个细胞分裂一次平均形成一个突变体。
三个经典实验: 变量实验、涂布实验、影印实验
证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！突变是自发产生的!

分子基础 :
自发突变的原因 : DNA聚合酶产生的错误; DNA的物理损伤; 重组 ; 转座; 等
主要原因: 碱基的互变异构; 移码突变; 转座因子插入突变.
移码突变的遗传学效应 ：① 插入突变（无义，有义）；② 导致染色体畸变；③ 基因移动和重排。

RNA基因组的突变 :
高于DNA基因组1000倍以上。
部分原因: RNA复制酶没有纠正活性；没有类似于DNA的修复机制。

(2). 诱发突变
许多化学、物理和生物因子（称为诱变剂mutagen) 能够提高突变频率，诱发突变并非是用诱变剂产生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率。
诱变剂 ：
• 碱基类似物(Base analog)：5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤
• 插入染料(intercalating dye) ：溴化乙锭和吖啶橙
• 直接与DNA碱基起化学反应的诱变剂：
ü 亚硝酸:引起含NH2基的碱基(A.G.C)产生氧化脱氨反应，造成碱基置换。
ü 羟胺:几乎只和胞嘧啶发生反应，因此只引起GC→AT的转换.
ü 烷化剂:甲磺酸乙酯和亚硝基胍烷基化鸟嘌呤和腺嘌呤, 烷化后的碱基也像碱基结构类似物一样能引起碱基配对的错误。
• 辐射和热 ：紫外线：T-T二聚体，SOS修复
χ-射线，γ-射线：DNA单链断裂；自由基。
热：胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶
• 生物诱变因子 ：

诱变剂与致癌物质——Ames试验
诱变剂的共性原则：
化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。
超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用；90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。
美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为Ames试验
具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his¯)的回复突变率。
(3) 回复突变(reverse mutation或back mutation)：
突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。
由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体外加入哺乳动物（如大鼠）微粒体酶系统，使待测物活化，使Ames试验的准确率达80-90%。

六、DNA损伤及其修复
主要的四种类型：光复活作用；切除修复；重组修复； SOS修复
光修复（光能）：光复活作用
暗修复（ATP）：切除修复，重组修复，SOS修复
1. 光复活作用：光解酶在黑暗中专一性识别嘧啶二聚体，并与之结合，形成酶-DNA复合物，当有光照时，酶利用光能将二聚体拆开，恢复原状，酶再释放出来
2. 切除修复
暗修复的一种，是细胞内主要的 修复系统。四种蛋白质联合作用：UvrA，UvrB，UvrC和UvrD
3. 重组修复：越过损伤而进行的修复。DNA的嘧啶二聚体仍然需经过其他的修复系统加以修复，或经过细胞的分裂而稀释。
4. SOS修复
DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。
涉及一批修复基因及产物：
recA（RecA，单链DNA的结合活性，以及由此而出的蛋白酶活性）
lexA（LexA，调节蛋白，与操作子结合阻止基因的转录,可以被RecA –DNA切割成2个部分,此时无阻遏功能）
uvrA（UvrA）
uvrB（UvrB）
uvrC（UvrC）
RecA与DNA的结合能够抑制DNA聚合酶III的3’-5’外切酶活性,使DNA聚合酶顺利通过损伤部位,以错误为代价的快速修复过程,导致突变而保存生命.

七、细菌基因转移和重组
细菌的四种水平基因转移形式
接合：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）
转导：由噬菌体介导
转化：游离DNA分子 + 感受态细胞
原生质体融合：细胞原生质体融合

1．细菌的接合作用(conjugation)
机制 (大肠杆菌的接合机制)
接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导，F因子的分子量通常为5×107(94.5kb)，上面有编码细菌产生性菌毛（sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。
含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛；
不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛。
F因子既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上.
F因子的四种细胞形式:
• F¯ 菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；
• F+菌株， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。
• Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。
• F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因 子。 细胞表面同样有性菌毛。
(1) F+×F¯杂交
F+菌株的F因子向F¯细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。
杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞
理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F¯菌株
(2) Hfr ×F¯杂交（参见P 217）
Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。
Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F¯细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细
胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F¯杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F¯。
(3) F′×F¯杂交
Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。
F′×F-与F+×F-的不同：给体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞
a）与染色体发生重组；
b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；
细胞基因的这种转移过程又常称为性导(sexduction），F因子转导（F-duction），F因子媒介的转导（F-mediated transduction）。

2． 细菌的转导（transduction）
由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。
能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体
细菌转导的二种类型：普遍性转导，局限性转导
(1) 普遍性转导（generalized transduction）
噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程
(2) 局限性转导（specialized transduction）
温和噬菌体感染，整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化，溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上（几率一般仅有10-6），部分缺陷的温和噬菌体，把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中。

3．细菌的遗传转化（genetic transformation）
同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程
自然遗传转化（natural genetic transformation）
人工转化（artificial transformation）
进行转化必要的二方面条件：
感受态的受体细胞:自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；
人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。
外源游离DNA分子:
转染(transfection)：噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒。特点：提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。

4．原生质体融合
两个亲本菌株去除细胞壁后的一种体细胞杂交育种方法
(1) 亲本及其遗传标记选择
营养缺陷、抗性标记、荧光染色标记等
(2) 原生质体制备
• 高渗溶液：无机盐（KCl, NaCl, MgSO4）、
有机物(蔗糖、甘露醇、山梨醇)
• 水解酶： 溶菌酶\蜗牛酶、纤维素酶、葡聚糖酶）
(3) 原生质体融合
化学融合法：30%-50%PEG(1000-6000)诱导，渗透压，低速离心1000-2000g
电融合:细胞在电场作用下,细胞内产生偶极化,促使细胞排列成串,外加瞬间高频直流强电压作用,原生质膜穿孔复原
(4) 原生质体再生
再生培养基高渗，无机盐/有机物，防止机械损伤
(5) 融合子选择
营养缺陷型, 抗性, 荧光染色标记, 钝化选择(亲本一方融合前50℃2-3h) ；连续传代几次

四种方法比较
类型
受体\供体是否接触
DNA传递媒介
重组涉及
DNA大小
接合
是
F因子
部分染色体
转导
否
噬菌体
一个或少数几个基因
转化
否
无
一个或少数几个基因
原生质体融合
原生质体 +
原生质体
2个细胞的基因组

八．微生物与基因工程
基因工程（genetic engineering）或重组DNA技术(recombinant DNA technology)：是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。
对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术：
DNA的特异切割；DNA的分子克隆（人工转化方法的建立）；DNA的快速测序；DNA合成技术；聚合酶链式反应（PCR）（DNA的体外扩增）；DNA的定位诱变技术。

M与基因工程的关系
• 基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；
• 基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；
• 微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；
①能够高效吸收外源DNA；
②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；
③不具有限制修饰系统；
④不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（RecA-）；
⑤便于进行基因操作、筛选和大量繁殖；
⑥具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。
• 为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；
• 微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；
• 有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。

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