SOD_测定方法.doc

SOD
氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力
一、原理
超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（O2-）的酶。实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料；水稻或小麦叶片
（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。
（三）试剂　1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。
三、实验步骤
1. 酶液提取　
取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应　
取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
3. SOD活性测定与计算　
至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。
四、结果计算
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)
上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定
【实验原理】
SOD是含金属辅基的酶，它催化以下反应：
02-+02-+ 2H+ H202+02
由于超氧阴离子自由基02-寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性,而采用
间接的方法。目前常用的方法有3种, 包括氮蓝四唑(NBT)光化还原法，邻苯三酚自氧化法，化学发光法。本实验主要介绍光化还原法，其原理是：氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收.
。SOD能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。
试剂:
　1.50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液(PBS) 。含0.1m mol/l EDTA
2.220m mol/l甲硫氨酸：称3.2824g甲硫氨酸\,用50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液定溶至100ml（现配现用）。
3.1.25m mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液（现配）：称NBT 0.102g,用
50m mol/l pH7.8的磷酸缓冲液(PBS)溶解定容至100ml.
4.0.033m mol/l核黄素：称2.52mg 用PBS溶解定容至200ml（遮光保存）。
【实验步骤】
1．酶液制备
称取植物组织0.5g先加入2.5ml PBS，研磨匀浆后，再加入2.5ml PBS混匀，
4℃下 10000r/min离心15min 上清液即为粗酶液。取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。
2.酶活性测定
取10ml小烧杯7只, 3只测定样品,4只作为对照，
按下表加入试计:
试剂
用量(ml )
终浓度(比色时)
50m mol/l (PBS)
220m mol/l Met
1.25m mol/l NBT
0.033m mol/l核黄素
酶液
总体积
4.05
0.3
0.3
0.3
0.05
5.0
13m mol/l
75µ mol/l
2.0µ mol/l
对照以缓冲液代替酶液
将上述试剂混匀后，1只对照烧杯至于暗处，另3只对照烧杯和样品一起置于
4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光一致，温度高时时间缩短，温度低时可适当延长）。
最后在560nm处测定反应液的光密度。以不照光的对照烧杯作参比，分别测定其
他各管的光密度。
3.蛋白含量的测定
步骤1的上清液经适当稀释后用考马斯亮蓝 G-250法测定蛋白含量.
【实验结果及计算】
SOD活性单位是以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。可按下式计
算SOD活性：
SOD总活性=
SOD比活力=SOD总活性/蛋白质总浓度
式中: SOD总活性以 U/gFW,比活力单位以 U/mg蛋白表示 ACK为对照杯(光照)的光吸收值;AE为样品的光吸收值;V为样液总体积,V1为测定时样品用量,W为样重g.
缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；
NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液
SOD的测定方法
加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3ml
EDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml
试剂配制：
(1) 0.05mol/L PBS：pH7.8
(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml
(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)
(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml
(5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存)
注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管
(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值

SOD活性的测定方法
[ 2005-10-31 12:51:00 | By: abingxu ]
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推荐pH7.8最适，按邵从本等（1993）方法。
1.试剂：
反应液：含13×10-3M 甲硫氨酸（MW=149.21292），75×10-6MNBT（MW=817.7），2×10-6M核黄素（MW=376.36），100×10-9MEDTA，50×10-3M磷酸缓冲液，pH7.8。
4.096225g Na2HPO4.12H2O，0.16576075g NaH2PO4.2H2O 用蒸馏水溶解，加入0.484942g 甲硫氨酸、0.01533g NBT、0.00075272g 核黄素（扩大10倍，溶于10ml蒸馏水，取0.25ml，此2种药剂现用现加）及0.000037224g EDTANa2（配时扩大100倍，用蒸馏水定容100ml后，取0.75ml），定容至250ml，4℃避光保存。
2．操作：
取30支粗细、厚薄一致的洁净试管，分别加入3.98反应液，29支加20ul( )酶液，另一支不加酶液加同样体积的提取缓冲液，以1支加酶的不作光照处理的为空白对照，余4000Lux照光20-25分钟后测OD560，每提取液重复3次，取平均值。
3.计算：在上述条件下，抑制50％NBT光化还原的酶量定为一个酶单位，按Constantine N. et al 1977(Pl. Physiol. 59:309-314)方法计算酶比活力。
SOD units/mg protein = {[ OD560 (不加酶)/ OD560（加酶）-1]×稀释倍数×4（反应液体积）}/
[0.02（所加酶液ml数）×每ml酶粗提液含蛋白mg]

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，EC 1.15.1.1） 参照Donahue等(1997)，Schickler 和Caspi (1999) 的方法。不同人工老化大豆种子的胚轴在液氮种迅速研磨程均匀粉末。约0.1 g材料于3 mL提取缓冲溶液（50mmol L－1 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH 7.0，含1.0 mmol L-1 EDTA，0.05％（V/V）Triton X-100，2％（W/V）不溶性聚乙烯吡咯烷酮）中研磨成匀浆。经过10000×g，5min和16000×g，20min，4℃下两次离心后，取上清液进行SOD活性测定。或液氮冷却后存于－80℃。
SOD酶活性测定利用SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下被·O2－还原的反应。反应液为含13 mmol· L-1甲硫氨酸（核黄素电子供体），75 μmol L-1氯化硝基四氮唑蓝, 16.7 μmol· L-1核黄素（产生·O2－），0.1 mmol L-1 EDTA 的50 mmol L-1磷酸缓冲液(pH 7.8)。在波长560nm处，检测吸光光度值。SOD活性以每mg蛋白抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位U。