熊果酸的含量测定.doc

野蔷薇根中熊果酸的提取工艺研究
努尔皮达·阿卜拉江 ，其买古丽·阿沙木，迪丽努尔·马里克*基金项目：国家自然科学基金（21165018）项目资助
作者简介：努尔皮达，女，（维吾尔族）硕士研究生，主要从事天然产物的研究。
联系作者：迪丽努尔.马里克（1964-），女，教授，主要从事天然产物研究。（pkudilnur@）

（新疆师范大学化学化工学院,新疆 乌鲁木齐 840054）
摘要：目的：优选野蔷薇根中熊果酸的超声提取工艺。方法：使用超声波提取法，采用L9(34)正交设计实验，用高效液相色谱法测定熊果酸的含量，确定最佳提取工艺条件。结果表明：野蔷薇根中熊果酸的提取最佳工艺是超声功率为600W，超声频率为工作5s间歇5s，料液比1：25，提取时间为30min，各因素的影响依次为超声波频率> 超声波功率>料液比和提取时间。结论：超声辅助提取野蔷薇根中熊果酸是一种简单、快捷、高效的提取方法。
关键词：野蔷薇；熊果酸；超声提取；HPLC法
Study on extraction technology of Ursolic acid
in Rosa multiflora Thunb
NURPIDA·Ablajan，QIMANGUL·Hasan，DILNUR·Malik
(School of chemistry and chemical engineering xin jiang normol university，Urumqi 830054）
Abstract: objective: to optimize the ultrasonic extraction of Ursolic acid in Rosa multiflora Thumb . Method: by utilizing the ultrasonic extraction method and using the orthogonal test of L9(34), with high-performance liquid chromatography (HPLC) to determine ursolic acid content and the optimum extraction conditions. The results show that the order of each factor affecting the extraction was ultrasonic frequency>ultrasonic power>ratio of liquid to material>extracting time, and the optimum conditions of extracting ursolic acid from the root of wild roses were as follows: ultrasonic power 600W, ultrasonic frequency of resting for 5s in the working period of 5s,ratio of liquid to material 1:25, extracting time 30min, . Conclusion: the ultrasonic-assisted extracting of ursolic acid from the root of wild roses is a simple, quick way of extraction with high efficiency.
Keywords: Rosa multiflora ; ursolic acid; Ultrasonic Extraction ; HPLC method
熊果酸(Ursolic acid)，又名乌苏酸、乌索酸、α-香树脂醇，是一种弱酸性五环三萜类化合物[1]。熊果酸纯品为白色针状结晶(乙醇中结晶)，味苦，具有多种生物活性，有镇静、抗炎、抗菌，降低血糖，抗肝炎[2]等多种生物学效应，熊果酸还具有明显的抗氧化功能[3]，所以是一种很有开发价值的植物活性成分，被广泛地用作医药和化妆品原料，日本等国家已经将其作为天然抗氧化剂应用于食品中[3]。新疆野蔷薇（Rosa spp）富含多种人体所需的营养物质[4-5]，有较大开发利用价值，现代研究证明，野蔷薇中含有熊果酸、齐墩果酸等三萜类化合物[6]。本文以野蔷薇根为原料，采用近几年兴起的新方法超声波法提取熊果酸，通过研究优化该方法工艺条件，旨在提高熊果酸产率，为进一步开发利用野蔷薇提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
野蔷薇根：采自阿勒泰县，粉碎，过筛，备用。
熊果酸标准品（中国药品生物制品检定所，批号110709-200304）；甲醇（色谱纯）；超纯水；乙醇（分析纯）。
高效液相色谱仪（安捷伦1200LC，美国）；色谱柱（安捷伦公司HC-C184.6×150mm，粒径为5μm）；JY92-2D超声波细胞粉碎机（波新芝生物科技股份有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 超声波提取样品液的制备
精密称取野蔷薇根粉末2g，按一定料液比，加人不同体积分数的乙醇，浸泡4h，于不同超声频率、不同功率下超声处理不同时间，静置放冷，滤过，重复2次，合并滤液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解定溶于50mL容量瓶中，作为测试样品。

1.2.2 熊果酸提取率的测定方法
1.2.2.1色谱条件
AgilentHC-C18(4.6mm×150mm，粒径为5μm）色谱柱；流动相为甲醇：水=50:50；流速0.5mL/min；检测波长为278nm；柱温室温；进样量为10μL。
1.2.2.2 标准曲线的绘制
精密称取干燥至恒重的熊果酸对照品3.3mg，置于5mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得含熊果酸0.66mg/mL 标准溶液，置4℃冰箱中保存。用母液依次配置浓度为528μg/mL、396μg/mL、264μg/mL、132μg/mL的标准溶液，进样10μL，测定峰面积。以峰面积平均值为纵坐标，其对应进样质量浓度为横坐标，进行回归计算，得线性方程为：y=39.197x-850.99，相关系数(R2=0.9977)。熊果酸浓度在132～528μg/mL，线性关系良好。
1.2.2.3 精密度实验
精密吸取熊果酸对照品溶液（528μg/mL）10μL，进样，连续测定5次，测定熊果酸对照品峰面积的RSD为1.62％(n=5)，结果表明仪器精密度良好。
1.2.2.4 加样回收率试验
精密称取已知含量的野蔷薇果皮0.20g，共5份，分别精密加入一定量的熊果酸对照品，按供试品溶液制各方法制备，采用上述色谱条件进行测定，结果表明，其平均回收率为101．8％，
表1加样回收率试验结果（n=5）
Tab.1 Expriment result of sample injecting recovery
样品序号 样品含量/mg 加样量/mg 测得量/mg 回收率/% 平均回收率/% RSD/%
1 0.521 0.528 1.041 98.48%
2 0.542 0.528 1.050 96.21%
3 0.532 0.528 1.046 97.35% 97.73% 1.02%
4 0.518 0.528 1.039 98.67%
5 0.525 0.528 1.042 97.92%

1.2.3样品测定
取测试样品用0.45µm微孔滤膜过滤，精密吸取10µ1，按上述色谱条件进行测定。重复进样三次，取均值，根据回归方程计算熊果酸的量。色谱图见图2。

图1 熊果酸对照品HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of comparative ursolic acid

图2 熊果酸样品HPLC色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of sample ursolic acid
上面的图可以看出这两个图的保留时间相等分离效率也比较好，说明在此条件下熊果酸峰与杂质峰能得到较好分离。
1.2.4 野蔷薇根中熊果酸提取工艺优化
1.2.4.1 正交实验因素水平设计：根据已有的资料和实际情况，选用提取时间(A)、超声频率(B)、超声功率(C)和料液比(D)作为考查因素，以野蔷薇果皮中熊果酸的提取效率为考查指标，选用L16(44)正交表，因素水平见表2。
表2 实验因素及水平
Tab.2 Fantors and levels
水平
因素
A功率 /W
B超声频率
C时间/min
D料液比/g/mL
1
200
工作5s间歇5s
10
1：20
2
400
工作6s间歇4s
20
1：25
3
600
工作7s间歇3s
30
1：30

2. 结果与分析
2.1 正交试验结果与数据分析
用HPLC法测定样品中熊果酸的含量(以每g野蔷薇果皮中含熊果酸mg计)的结果如下表3。
表3 L16(44)正交试验设计及结果
Tab.3 Resouts of L16(44) orthogonal test
试验号
超声功率A
频率B
时间C
料液比D
提取量mg/g
1
1
1
1
1
2.112
2
1
2
2
2
1.842
3
1
3
3
3
1.657
4
2
1
2
3
2.085
5
2
2
3
1
1.925
6
2
3
1
2
1.731
7
3
1
3
2
2.327
8
3
2
1
3
1.876
9
3
3
2
1
1.749
k1
1.8703
2.175
1.906
1.929

k2
1.9137
1.881
1.892
1.9667

k3
1.984
1.712
1.9697
1.873

R
0.1137
0.4627
0.078
0.094

由试验结果并通过极差R的大小可知,各试验因素对熊果酸提取率影响的大小次序为：B>A>D>C，即对野蔷薇果皮中熊果酸提取影响最大的因素是超声频率，超声功率和料液比影响次之，超声时间影响最小。最佳提取工艺条件为：A3B1C3D2，，即超声功率为600W，超声频率为工作5s间歇5s，料液比我1：25，提取时间为30min。
2.3 正交实验结果的验证
按2.1正交实验的最佳工艺条件进行1.2.1实验，平行三次，取平均值，得最佳提取条件下熊果酸的提取率为2.426 mg/g。

3. 结论
野蔷薇根中熊果酸的最佳提取工艺参数：超声功率为600W，超声频率为工作5s间歇5s，料液比我2：25，提取时间为30min。。在最优因素水平组合条件下，熊果酸提取率为2.426 mg/g。
超声辅助提取野蔷薇果皮中熊果酸主要是利用超声波的空化作用，即一定频率的超声波对细胞的破化有助于有效成分的溶出，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，有利于提取。
采用高效液相色谱法对熊果酸的含量进行分析，建立了快速，简便，灵敏的HPLC测定方法。分析结果表明，该方法简单快速，高效灵敏，重现性好。
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