不同居群北柴胡ISSR遗传多样性分析.pdf

生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 6 期 919 924Current Biotechnology ISSN 20952341研究论文研究论文Articles不同居群北柴胡ISSR遗传多样性分析闫晓睿，薛帼珍，杨晓霞，王宇，杜晨晖，张朔生，刘计权*山西中医药大学中药与食品工程学院，山西 晋中 030619摘要：利用简单重复间序列（inter-simple sequence repeat,ISSR)分子标记技术对10个不同居群的北柴胡样品进行遗传多样性分析，为进一步开展北柴胡优良种质的选育提供依据。以不同居群的北柴胡新鲜叶片为材料，用植物组织DNA提取试剂盒提取北柴胡样品DNA。利用单因素梯度实验研究最佳ISSR-PCR反应体系，将不同居群的DNA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用NTSYS-pc软件分析不同居群北柴胡的遗传多样性。结果发现，10个居群的北柴胡遗传相似系数介于0.142 81.000 0。经聚类分析，10个不同居群的北柴胡分为3大类，第1类为甘肃北柴胡；第2类包括5个北柴胡样品，分别为陵川、河南、闻喜、平陆、襄汾北柴胡，均属于山西省晋南居群；第3类包括4个北柴胡样品，分别为内蒙古、临汾、浑源、广灵北柴胡，类属于山西省北部居群及内蒙古居群；10个居群的北柴胡存在比较丰富的遗传多样性，且与其地理环境有一定的关联性。研究结果可为北柴胡种质资源保护及优良种质选育提供理论依据。关键词：北柴胡；ISSR；PCR扩增；聚类分析；遗传多样性DOI：10.19586/j.20952341.2023.0084 中图分类号：Q37，R932 文献标志码：AISSR Genetic Diversity Analysis of Bupleurum chinense from Different PopulationsYAN Xiaorui，XUE Guozhen，YANG Xiaoxia，WANG Yu，DU Chenhui，ZHANG Shuosheng，LIU Jiquan*College of Chinese Medicine and Food Engineering，Shanxi University of Chinese Medicine，Shanxi Jinzhong 030619，ChinaAbstract：The genetic diversity of 10 different populations of Bupleurum chinense was studied by inter-simple sequence repeat（ISSR）molecular marker technique，in order to provide basis for further breeding of B.chinense.The DNA of Bupleurum chinense samples from fresh leaves of different populations was extracted by the plant tissue DNA extraction kit.The single factor gradient experiment was used to study the optimal ISSR-PCR reaction system.The DNA amplification products of different populations were subjected to agarose gel electrophoresis，and the genetic diversity of different populations of B.chinense was analyzed by NTSYS-pc software.The results showed that the genetic similarity coefficient of 10 populations ranged from 0.142 8 to 1.000 0.10 different populations were divided into three categories by cluster analysis，with the first category being Gansu.The second category included five samples of B.chinense，Lingchuan，Henan，Wenxi，Pinglu，and Xiangfen，all belonging to the Jinnan population in Shanxi Province.The third category included four samples，namely Inner Mongolia，Linfen，Hunyuan，and Guangling，belonging to the northern population of Shanxi Province and Inner Mongolia.The 10 populations of B.chinense have relatively abundant genetic diversity and are related to their geographical environment.The results could provide theoretical basis for germplasm resources protection and elite germplasm breeding of B.chinense.Key words：Bupleurum chinense；ISSR；PCR amplification；cluster analysis；genetic diversity收稿日期：20230615；接受日期：20231016基金项目：山西省自然基金面上项目（20210302123233；20230602324694）；山西道地药材品质形成机制创新团队项目（2022TD2009）；山西中医药大学中药资源学科建设项目（2023XKJS-24）；山西中药材产业技术体系项目（CZ2023018）；山西中医药大学太行本草专项（2022PY-TH-30）。联系方式：闫晓睿 E-mail:；*通信作者 刘计权 E-mail:生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology中药柴胡最早出现于 神农本草经，被列为“上品”，到目前为止已经使用了两千多年 1。柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根，按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”2。柴胡具有解表和里、疏肝解郁、升提中气之功效，主治感冒发热、寒热往来、黄疸肝炎及月经不调等 3。其中，北柴胡主要产自山西、河北、河南、辽宁等省份，而南柴胡主要产于湖北、四川、安徽等省份。根据相关资料显示，全世界柴胡属植物大约有200种，我国现已明确的柴胡属植物共有42个种、17个变种和7个变型 4-6。除海南省外，柴胡在我国其他省份都有分布 7。柴胡种源丰富，在一定程度上给鉴别工作带来了不小难度。自古以来，山西省都是道地药材柴胡的重要产地之一，省内南北地理较大的跨度导致柴胡在不同的地理位置、气候、水土等条件影响下的内在质量和外观性状良莠不齐。因此，对不同来源柴胡的遗传多样性及其亲缘关系进行分析具有重要意义。现阶段对柴胡真伪鉴别的方法有随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）、内源转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）片段及ISSR分子标记等8。本研究采取液氮研磨提取法，提取了 10 个不同居群的北柴胡 DNA，对其ISSR-PCR反应体系进行优化，并研究了10个居群的北柴胡样品的种内亲缘关系，以期为胡柴的良种选育、规范化栽培和临床应用提供一定参考。1材料与方法1.1仪器与试药AB135-S型电子分析天平购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HH-4数显恒温水浴锅购自金坛市杰瑞尔电器有限公司；H2016D高速离心机购自上海知信实验仪器有限公司；MX-S涡旋振荡器购自大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；EasyCycler 96PCR扩增仪购自德国耶拿分析仪器股份公司；DYY-6C型稳压稳流电泳仪购自北京市六一生物科技有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度计购自美国 Thermo公司；ZF-258全自动凝胶成像分析系统购自上海嘉鹏科技有限公司；TWD-9403C紫外仪购自北京六一生物科技有限公司。DP3112植物组织DNA提取试剂盒购自无锡百泰克生物技术有限公司；Premix Taq DNA酶购自宝日医生物技术有限公司；引物由美国Thermo公司合成；DL2000 DNA Marker、琼脂糖、5TBE缓冲液、无酶无菌水、TE缓冲液均购自北京索莱宝科技有限公司。1.2实验材料实验用北柴胡供试品来源于甘肃、山西、河南、内蒙古等10个产地（表1）。于2021年4月15日5月1日进行取样，分别取各居群新鲜、健康的柴胡植株叶片叶尖。将采集样品带回实验室-25 保存备用。所有实验材料经山西中医药大学刘计权教授鉴别，均属于伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.。1.3北柴胡DNA的提取取新鲜北柴胡叶片叶尖适量，加入液氮充分研磨至细粉状。参照植物组织DNA提取试剂盒说明书提取样品DNA，采用精密紫外分光光度计测表1不同产地北柴胡环境因子原始数据Table 1Raw data of environmental factors of B.chinense from different producing areas产地甘肃省庆阳市董志镇董志村山西省陵川县潞城镇潞城村山西省闻喜县后宫乡古塬庄村山西省平陆县张店镇候王村河南省嵩县车村镇河北村内蒙古清水河县城关镇城关村山西省临汾贺家庄乡贺家庄村山西省浑源千佛岭乡宽坪村山西省广灵县南村镇鳌裕村山西省襄汾县南辛店乡中陈村东经107.27113.25111.54111.17112.12111.82111.64113.74114.14111.43北纬35.2535.6535.3434.9933.7940.3835.9839.4539.7435.92海拔/m1 421.001 104.001 072.00758.00890.001 199.00799.001 910.001 325.00414.00年均温/10.009.8012.5013.8014.806.5012.106.207.0011.50年平均降雨量/mm547.00703.00439.80673.00600.00398.20514.80424.60388.00550.00年平均日照/h2 465.302 663.002 461.002 226.002 296.002 913.002 466.702 696.001 500.002 228.00无霜期/d175.00183.00190.00230.00187.00128.00190.00130.00134.00185.00920闫晓睿，等：不同居群北柴胡ISSR遗传多样性分析定OD260/OD280及 DNA 浓度，剩余的 DNA 样品于-20 低温保存备用。1.4反应体系的优化1.4.1Premix Taq-DNA 酶的最佳加入量结合文献9-10及预实验结果综合分析，反应程序为：94 预变性5 min；94 变性1 min，52 退火45 s，72 延伸 2 min，共 45 个循环；最后 72 延伸7 min。本实验使用引物808，PCR扩增采取25 L反应体系，包括模板DNA 20 ng、10 mol L-1引物2 L，Premix Taq DNA酶设置了10.0、12.5、15.0 L 3个体积，无酶无菌水补足。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，5 V cm-1电压条件下电泳45 min，以DL2000 DNA marker为对照，用凝胶成像系统拍照并记录结果。1.4.2模板 DNA 的最佳加入量在确定 Premix Taq-DNA酶量的基础上，设置20、40、60 ng 3个模板 DNA 用量梯度，观察模板 DNA 用量对 ISSR-PCR扩增的影响，选择最佳加入量。1.4.3最适引物及最佳加入量参照 UBC 发布的ISSR引物，并结合相关文献11-13，选取扩增条带较多且条带清晰的引物，每种引物分别设置1、2、4 L 3个梯度。将扩增产物放置于紫外照射箱观察，依据生成条带的明显程度，筛选出最适合的引物种类与浓度。1.5不同居群北柴胡遗传多样性分析对 10 个北柴胡的 DNA 样品进行 ISSR-PCR 扩增，并统计扩增条带。按相同迁移位置上有扩增条带的不论强弱记为“1”，无带记为“0”，得到全部样品的图谱二态数据矩阵，用 NTSYSpc-2.1软件进行计算，获得样品的遗传相似系数矩阵。用UPGMA方法依据遗传相似系数进行聚类分析，并构建聚类系统树状图。2结果与分析2.1北柴胡DNA的提取经超微量分光光度计测量，液氮提取不同居群北柴胡DNA所得结果较为良好，OD260/OD280比值均高于1.8，证明10个样地所提取的双链DNA纯度较高，可用于后续实验。具体测定结果见表2。2.2反应体系的优化2.2.1Premix Taq-DNA 酶的最佳加入量由图1可知体系中加入 10 L 和 15 L Taq-DNA 酶时，呈现的条带亮度较弱，当加入 12.5 L Taq-DNA酶时，出现了特征明显的发光亮带。因此，在本次实验条件下，25 l反应体系中Taq-DNA酶最适用量为12.5 L。表2柴胡样品的DNA浓度和质量Table 2DNA concentration and quality of B.chinense samples居群庆阳陵川闻喜平陆嵩县清水河临汾浑源广灵襄汾浓度/(ngL-1)107.3170.1246.6152.1170.1137.4109.3216.0113.3109.4纯度/(A260/A280)1.942.182.132.062.182.012.222.002.292.22注：MDL2000 DNA marker；1610 L Premix Taq-DNA酶；71212.5 L Premix Taq-DNA酶；131715 L Premix Taq-DNA酶。图1Premix Taq-DNA酶含量对ISSR-PCR扩增的影响Fig.1Effect of premix Taq-DNA enzyme content on ISSR-PCR amplification921生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology2.2.2模板DNA的最佳加入量由图2所示，当模板 DNA 为 20 ng时，扩增条带较弱；40 ng时扩增条带最弱且不清晰，而DNA用量为60 ng时扩增结果最佳，因此本实验选择60 ng为反应体系中模板DNA的用量。2.2.3最适引物及最佳加入量依据上述实验结果确定了引物种类与用量，选取4条扩增条带较多且条带清晰的引物（表3）。由图3可以看出当选择 840 引物 2 L 时，条带清晰且稳定。因此，本实验选择 840 作为最适引物，引物量以2 L为最佳。2.3不同居群北柴胡遗传多样性分析2.3.1ISSR-PCR扩增检测由2.2进行的ISSR-PCR反应体系优化实验，确定ISSR-PCR分析最适宜的25 L PCR 反应体系：模板DNA 60 ng，Premix Taq DNA酶12.5 L，840引物（10 mmol L-1）2 L，无酶无菌水补足。10个北柴胡样品使用840引物均可以扩增出清晰的条带，大部分扩增片段分子量在2501 500 bp，具体结果如图4所示。2.3.2北柴胡样品遗传相似性分析由表 4 可知，10个北柴胡样品的遗传相似系数为0.142 81.000 0。其中，襄汾、浑源、广灵与庆阳柴胡之间的遗传相似系数最小为 0.142 8，闻喜与平陆柴胡、清水河与临汾柴胡、陵川与嵩县柴胡、广灵与浑源柴胡之间的遗传相似系数最大为1.000 0，这表明10个北柴胡样品种间存在着一定程度的遗传差异。从遗传相似系数可看出，庆阳柴胡与其他9个产地柴胡的遗传相似系数均较小，表明其亲缘关系较远；而这9个产地柴胡两两间存在着注：MDL2000 DNA marker；1520 ng DNA；61040 ng DNA；111560 ng DNA。图2模板DNA用量对ISSR-PCR扩增的影响Fig.2Influence of template DNA dosage on ISSR-PCR amplification表3北柴胡ISSR分析的引物序列及其最佳退火温度Table 3Primers sequence and optimum annealing temperature for ISSR analysis of B.chinense引物808811836840引物序列（5 3）5-AGAGAGAGAGAGAGAGC-35-GAGAGAGAGAGAGAGAC-35-AGAGAGAGAGAGAGAGCTA-35-GAGAGAGAGAGAGAGACTT-3退火温度/52.054.552.051.3注：MDL2000 DNA marker；13引物808用量依次为1、2、4 L；46引物811用量依次为1、2、4 L；79引物836用量依次为1、2、4 L；1012引物840用量依次为1、2、4 L。图3不同引物及用量对ISSR-PCR扩增的影响Fig.3Influence of different primers and dosage on ISSR-PCR amplification922闫晓睿，等：不同居群北柴胡ISSR遗传多样性分析不同程度的遗传相似性，表明9个北柴胡样品种间存在着一定程度的遗传差异。2.3.3聚类分析由图 5所示，相似系数为 0.63时，可把10个北柴胡样品聚成3大类。第1类只有甘肃庆阳柴胡；第2类包括5个柴胡样品，分别为陵川、嵩县、闻喜、平陆、襄汾柴胡，均属于山西省南部居群及河南省居群，其中陵川与嵩县亲缘关系较近，闻喜与平陆亲缘关系较近；第3类包括4个柴胡样品，即为清水河、临汾、浑源、广灵柴胡，属于山西省北部居群及内蒙古居群。其中，浑源与广灵亲缘关系较近，临汾与清水河亲缘关系较近。3讨论物种或居群的遗传多样性大小是长期进化的产物，也是其生存和发展的前提11，居群间存在遗传多样性或遗传变异，一部分原因是由于环境因素的改变和土壤条件的恶化。遗传相似性系数或遗传距离是衡量居群间遗传分化程度的重要指标12。因此，对遗传多样性的研究一方面解释了物种的进化，另一方面也为寻找优良的种质资源提供理论依据。目前，用于中药材的分子标记技术很多，例如SCoT、ISSR、SSR、SNP等，其中ISSR技术有着多态性高、重复性好、操作简单、成本低廉等优图5北柴胡居群的遗传多样性聚类图Fig.5Clustering map of genetic diversity of B.chinense population注：MDL2000 DNA marker。图410份北柴胡样品的ISSR-PCR扩增结果Fig.4ISSR-PCR amplification results of 10 B.chinense samples表410份北柴胡样品的遗传相似系数Table 4Genetic similarity coefficients of 10 B.chinense samples庆阳陵川闻喜平陆嵩县清水河临汾浑源广灵襄汾庆阳1.000 00.285 70.285 70.285 70.285 70.428 50.428 50.142 80.142 80.142 8陵川1.000 00.714 20.714 21.000 00.571 40.571 40.571 40.571 40.571 4闻喜1.000 01.000 00.714 20.571 40.571 40.571 40.571 40.857 1平陆1.000 00.714 20.571 40.571 40.571 40.571 40.857 1嵩县1.000 00.571 40.571 40.571 40.571 40.571 4清水河1.000 01.000 00.714 20.714 20.714 2临汾1.000 00.714 20.714 20.714 2浑源1.000 01.000 00.714 2广灵1.000 00.714 2襄汾1.000 0923生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology点，且能够在样品基因组序列未知的情况下对样品间的遗传信息进行多样化分析，同时不受物种的限制，在香附、黄精、伊贝母、柴胡等重点中药材上已有相关应用13-14。此外，引物浓度也会影响实验结果，浓度过高可能导致非特异性产物扩增，产生错误引导或产生引物二聚体，过低可能降低PCR扩增效率15。因此，有必要围绕引物适宜的浓度进一步设置梯度浓度以探究实验的最优条件。从聚类图中可以看出，第2类中5个北柴胡样品不仅仅局限于山西省南部居群，还有河南省嵩县北柴胡样品与其聚为一类，这可能是因为两地相邻，生境、光温水等条件较为一致，导致北柴胡间的遗传相似系数较近；第3类中内蒙古清水河居群北柴胡未按照其地理位置独为一类，而是与山西北部居群聚为一类。这可能是山西北部地区由于受内蒙古冬季冷气团的袭击，气候较为寒冷，两地环境条件较为相似，自然选择压力一致导致的。因此，可以推断亲缘关系与地理位置的远近有着密切的联系。李勇慧等 8 通过对我国北柴胡6个居群的11个样品进行遗传多样性分析，发现6个居群北柴胡存在比较丰富的遗传变异，且与地理分布有一定相关性。马艳芝等9采用ISSR标记和ITS序列分析方法将11份柴胡样品分成2大类，其中大部分来源相同或相近的柴胡样品聚在一起。以上文献有关结论与本研究聚类分析结论基本一致。随着北柴胡的经济价值与药用价值不断被开发，北柴胡的需求量逐日递增，越来越多的地方正在进行北柴胡的栽培，但产地之间的亲缘关系并不清楚。当前越来越多的中药材已经开始在分子层面上进行分析，足见分子技术对中药材研究的重要性。本研究从ISSR分子标记技术获得的结果来看，不同柴胡种群间存在较为丰富的遗传多样性，原则上能够按照地理位置的远近加以分类，这对于柴胡遗传差异性的深入研究、种质评价和良种选育均有重要意义。未来，课题组将会在实验结果的基础之上深入研究北柴胡遗传多样性与化学成分、外观性状之间的关联。参 考 文 献 1 森立之.神农本草经M.上海:上海科技卫生出版社,1959:35.2 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