苯线磷和甲胺磷对TF-1细胞乙酰胆碱酯酶影响的差异.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 4 期 2023 年 8 月Vol.18,No.4 Aug.2023 基金项目:国家自然科学基金青年项目(22206202);国家自然科学基金重点项目(21836004);国家重点研发计划项目(2018YFA0901100)第一作者:陈旸升(1989),男,博士,研究方向为环境神经毒理学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230426001陈旸升,马永超,彭颖蓓,等.苯线磷和甲胺磷对 TF-1 细胞乙酰胆碱酯酶影响的差异J.生态毒理学报,2023,18(4):231-240Chen Y S,Ma Y C,Peng Y B,et al.Differential effects of fenamiphos and methamidophos on acetylcholinesterase in TF-1 cells J.Asian Journal of Ec-otoxicology,2023,18(4):231-240(in Chinese)苯线磷和甲胺磷对 TF-1 细胞乙酰胆碱酯酶影响的差异陈旸升1,马永超1,彭颖蓓1,2,徐丽1,谢群慧1,2,*,赵斌1,21.中国科学院生态环境研究中心,环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京 1000852.中国科学院大学资源与环境学院,北京 100049收稿日期:2023-04-26 录用日期:2023-05-23摘要:有机磷农药(organophosphorus pesticides,OPs)具有较强的神经毒性,主要是通过抑制胆碱能神经传导中的关键酶,乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE,EC 3.1.1.7)的活性来实现的。苯线磷和甲胺磷是广泛用于农业生产的 OPs,但对它们抑制人 AChE 活性的机制研究十分有限。本研究应用 2 种不同的给药方式,包括对培养的细胞和细胞裂解液进行药物处理,明确苯线磷和甲胺磷对人血液白血病细胞系 TF-1 中 AChE 酶活性的直接作用和对 AChE 基因转录表达的影响,从而揭示苯线磷和甲胺磷抑制 AChE 酶活性的机制与两者的差别。结果表明,高浓度苯线磷(10-3mol L-1)处理后,TF-1 细胞活力降低,同时诱导细胞凋亡和坏死;而所有被试浓度的甲胺磷对细胞活力均没有明显影响。此外,对于 TF-1 细胞裂解液中的 AChE,苯线磷和甲胺磷短期处理(1 h 和5 h)均可产生直接抑制作用,其中苯线磷的抑制作用略强于甲胺磷(孵育1 h,IC50值分别为1.18110-6mol L-1和 2.83710-6mol L-1)。对培养细胞的药物处理实验结果显示,苯线磷和甲胺磷(10-6mol L-1和 10-5mol L-1)处理 24 h 后,均显著降低了 TF-1 细胞的 AChE 酶活性,苯线磷的抑制率略高于甲胺磷。而与对酶活性的抑制作用相反,苯线磷和甲胺磷对 TF-1 中AChEH转录本表达有轻微的上调作用,以甲胺磷更为明显,提示存在反馈调节机制。总结上述结果,我们?发现苯线磷对 TF-1 细胞中 AChE 的抑制作用总体略强于甲胺磷,而甲胺磷对AChE基因表达的反馈上调作用更明显。从而?首次从对 AChE 酶的直接抑制作用和生物合成影响的不同角度阐述了 2 个 OPs 对 AChE 影响的差异,为进一步的分子机制研究提供了实验数据。关键词:苯线磷;甲胺磷;乙酰胆碱酯酶(AChE);人血液白血病细胞 TF-1文章编号:1673-5897(2023)4-231-10 中图分类号:X171.5 文献标识码:ADifferential Effects of Fenamiphos and Methamidophos on Acetylcholinest-erase in TF-1 CellsChen Yangsheng1,Ma Yongchao1,Peng Yingbei1,2,Xu Li1,Xie Qunhui1,2,*,Zhao Bin1,21.State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology,Research Center for Eco-Environmental Sciences,ChineseAcademy of Sciences,Beijing 100085,China2.College of Resources and Environment,University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,ChinaReceived 26 April 2023 accepted 23 May 2023Abstract:Organophosphorus pesticides(OPs)have strong neurotoxicity,which is through the inhibition of acetyl-232 生态毒理学报第 18 卷cholinesterase(AChE,EC 3.1.1.7),an enzyme critical for cholinergic neurotransmission.Fenamiphos and methami-dophos are widely used OPs in agricultural production,but research on their mechanisms of inhibiting humanAChE activity is limited.In this study,the effect of fenamiphos and methamidophos on AChE enzyme activity inhuman erythroleukemia cell line TF-1 and their impact on AChE gene transcriptional expression were clarified.Theresults showed that after treatment with high concentration of fenamiphos(10-3mol L-1),the cell viability of TF-1cells decreased,while inducing cell apoptosis and necrosis;however,all concentrations of methamidophos testedhad no significant effect on cell viability.In addition,short-term(1 h and 5 h)treatment with fenamiphos andmethamidophos lead to direct inhibitory effects on AChE in TF-1 cell lysate,with fenamiphos having a slightlystronger inhibitory effect than methamidophos(1 h incubation,IC50value is 1.18110-6and 2.83710-6mol L-1,respectively).The results of these two OPs on cultured cells showed that after 24 h of treatment with fenamiphosand methamidophos(10-6mol L-1and 10-5mol L-1),the AChE enzyme activity of TF-1 cells was significantlyreduced,and the inhibition rate of fenamiphos was slightly higher than that of methamidophos.Contrary to the in-hibitory effect on enzyme activity,both fenamiphos and methamidophos slightly upregulated the expression ofAChEHtranscripts in TF-1,with methamidophos being more obviously,indicating a feedback regulatory mecha-?nism.Based on the above results,we found that the inhibitory effect of fenamiphos on AChE in TF-1 cells is gen-erally slightly stronger than that of methamidophos,and there is feedback upregulation effect of methamidophos onAChEgene expression.Thus,for the first time,the differences in the effects of two OPs on AChE were elucidatedfrom different perspectives of direct inhibition of AChE enzyme and biosynthesis,providing experimental data forfurther molecular mechanism research.Keywords:fenamiphos;methamidophos;acetylcholinesterase(AChE);TF-1 cells 有机磷农药(organophosphorus pesticides,OPs)是世界范围内广泛使用的杀虫剂,也是在河流、地下水、土壤、空气和植物中最常检出的合成化学品之一。OPs 具有较强的神经毒性,对乙酰胆碱酯酶(acetylcholine E,AchE,EC 3.1.1.7)酶活性的抑制是OPs 毒性作用机制之一。这种抑制作用直接导致神经递质乙酰胆碱在突触间隙积聚,进而干扰胆碱能信号传导1-3。正是由于 OPs 对人类具有急性和慢性毒性,使其在公共卫生领域一直备受关注。然而,由于暴露途径和/或与 AChE 的相互作用模式的多样性,暴露于不同的 OPs 可能会导致不同的毒理学路径和结局4-5。大多数的 OPs 会经生物转化为毒性更强的 OP 形式,而苯线磷和甲胺磷与众所周知的神经毒剂塔崩(Tabun)类似,已经具有 OP 形式,因此苯线磷和甲胺磷是与 Tabun 类似的 AChE 抑制剂6-8。苯线磷和甲胺磷是 2 种 OPs 杀虫剂,近年来常用于防治水果、蔬菜和农作物上的各种害虫9-11。Akoto 等12在一项针对加纳蔬菜产品的研究中发现,所有蔬菜产品中甲胺磷的含量都超过了最大残留限量。同时,在中国的蔬菜剩菜中也发现了甲胺磷13。研究发现,在蔬菜中发现的残留的杀螨磷和甲胺磷会增加人体暴露的风险。在以色列,已经发现儿童比成年人摄入更多的苯线磷和甲胺磷,并且暴露水平被认为分别超过可接受的每日摄入量25%和 50%14。由于脐带血样本中也有甲胺磷被检出,因此胎儿同样面临着接触甲胺磷的风险15。基于经口或经皮暴露大鼠的 LD50值,世界卫生组织(WHO)在“世界卫生组织推荐的农药危险分类”中将苯线磷和甲胺磷列为“高度危险(b 类)”。人群队列研究和动物实验结果显示,这 2 种 OPs 对人体和实验动物中均有毒性。在厄瓜多尔,苯线磷暴露的工人的染色体畸变的频率增加1,而长期接触甲胺磷影响小鼠大脑发育2。然而,这些毒性作用机制尚不完全清楚。红细胞 AChE 的酶活性是评估 OPs 中毒的经典生物标志物之一16。此外,红细胞也是 OPs 发挥毒性的靶细胞。一些血液疾病的发生,如白血病,与OPs 暴露有关7,17。TF-1 是一种人类红白血病细胞系,已被用于研究 AChEH在成红血细胞分化过程中表达的调节机制。因此,在本研究中,使用 TF-1 细胞来研究苯线磷和甲胺磷对人 AChE 的影响。包括在 TF-1 细胞裂解液中进行体外研究,明确 OPs 对AChE 活性的影响,以及这 2 种 OPs 与人 AChE 的直接相互作用情况。同时,进行 TF-1 细胞 OPs 给第 4 期陈旸升等:苯线磷和甲胺磷对 TF-1 细胞乙酰胆碱酯酶影响的差异233 药处理,以明确 OPs 对人 AChE 的细胞酶活性和AChEmRNA 表达的影响。本文不但揭示了苯线磷?和甲胺磷对人 AChE 的影响情况,同时还比较了这2 种 OPs 对 TF-1 细胞的细胞毒性差异。本研究将为 OPs 的健康风险评估提供理论依据。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 实验材料人红细胞白血病淋巴细胞(TF-1)购自中国医学科学院细胞资源中心。1640 培养基、0.25%胰酶、青霉素/链霉素、GlutaMAX、GeneJET RNA 纯化试剂盒和 RevertAid First Strand cDNA 反转录试剂盒均购自 Thermo Fisher Scientific 公司,胎牛血清、EllmanAssay 检测试剂与二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DM-SO;纯度 99.9%)购自 Sigma-Aldrich 公司。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CCK-8 检测试剂盒购自上海生工公司,膜联蛋白 V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天公司。苯线磷(CAS:22224-92-6,纯度:99.4%)和甲胺磷(CAS:10265-92-6,纯度:99.5%)分别购自 TM 标准品公司和 CATO公司。GoTaqqPCR Master Mix 荧光定量试剂盒购自 Promega 公司。荧光定量 PCR 仪(QuantStu-dioTM6 Flex,Life,USA),流 式 细 胞 仪(Novocyte1040,Agilent,美国),分光光度计(CARY 300,Agilent,美国),酶标仪(Infinite F200 Pro,Tecan,瑞士),核酸微量定量仪(NanoDrop 2000,Thermo Scientific,美国)。1.2 细胞培养及处理使用 1640 基础培养基混合 10%胎牛血清、100U mL-1青霉素/100 gmL-1链霉素、4 mmolL-1GlutaMAX 和 8 ng mL-1GM-CSF 配制完全培养基培养 TF-1 细胞。培养箱条件设置为:5%CO2、饱和湿度、37。将 TF-1 细胞悬液以每孔 8105个细胞的密度接种到6 孔板中,24 h 后进行样品暴露,苯线磷暴露于细胞的终浓度为 10-7、10-6、10-5、10-4和10-3mol L-1,甲胺磷的最终浓度为 10-7、10-6、10-5和 10-4molL-1,所有样品溶剂包括对照组 DMSO的体积浓度均为 0.05%。1.3 细胞活力和增殖实验将 TF-1 细胞与苯线磷或甲胺磷一起孵育,并以适当的密度接种到 96 孔板中。24 h 后,用 CCK-8溶液(10 L 孔-1)处理 TF-1 细胞,然后在 37 下孵育1 h,随后使用酶标仪(TECAN Infinite F200 Pro)在450 nm 处测量光密度(OD)值。计算过程如下:细胞活力=(实验组 OD 值-空白组 OD 值)/(对照组 OD 值-空白组 OD 值)(1)实验组:含 TF-1 细胞、CCK-8 溶液、苯线磷或甲胺磷。对照组:含 TF-1 细胞、CCK-8 溶液、二甲基亚砜。空白组:含培养基,CCK-8 溶液。1.4 流式细胞术根据膜联蛋白 V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒操作说明,将 TF-1 细胞用苯线磷或甲胺磷处理,然后以8105个细胞的密度接种到6 孔板中。24 h 后收集 TF-1 细胞,将膜联蛋白 V-FITC 结合溶液(195 L 管-1)加入每个处理组中,然后加入 5 L 膜联蛋白V-FITC 和10 L 碘化丙啶(PI),在室温下避光孵育20min 后,使用流式细胞仪(Novocyte 1040)读取数据。1.5 AChE 酶活定量分析采用改良的 Ellman Assay18对 AChE 酶活性进行定量分析,具体操作如下:使用低盐裂解缓冲液(LSLB;10 mmolL-1HEPES、150 mmolL-1NaCl、1 mmol L-1EDTA、1 mmolL-1EGTA、0.5%TritonX-100 和 4 mmol L-1苯甲脒)在 4 下提取 TF-1 细胞裂解物 30 min,然后在室温下将细胞上清液与不同浓度的苯线磷或甲胺磷孵育。1 h 后,将细胞样品用于 Ellman 测定。此外,将 TF-1 细胞在含有苯线磷或甲胺磷的培养基中培养 24 h,然后收集经LSLB 裂解的细胞上清液用于实验。将细胞上清液加入 96 孔板中,并与 80 mmolL-1磷酸氢二钠、0.1mmol L-1四异丙基焦磷酰胺(ISO-OMPA)和 0.5mmol L-15,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)一起孵育 30 min 后,将 0.625 mmol L-1乙酰硫代胆碱碘化物(ATCH)加入每个孔中。在酶标仪中每5 min 读取一次 405 nm 处的吸光值,持续 100 min。使用Bradford 方法测量蛋白质浓度。酶活力单位为单位时间每微克蛋白质的催化速度。为了评估抑制常数,将人重组 AChE 与苯线磷(1010-615010-6mol L-1)或甲胺磷(510-64010-6mol L-1)在室温下孵育。通过在指定时间(最长 60 min)加入 ATCH 停止进行性抑制,并测量残余酶活性。二阶抑制速率常数(ki)采用已发表的方法?进行计算19-20。在甲胺磷的情况下,ki是kobs对浓?度曲线的斜率,而在苯胺磷饱和曲线情况下,ki是?通过双曲线拟合计算的最大抑制速率常数和解离常数的比值。所有活性测量均在含 0.01%BSA 的 0.1mol L-1磷酸钠缓冲液中进行,25 时 pH 值为 7.4,使用带有温度控制器的 CARY 300 分光光度计测定在 412 nm 的 OD 值。234 生态毒理学报第 18 卷1.6 荧光实时定量 PCR采用 GeneJET RNA 纯化试剂盒从 TF-1 细胞中提取总 RNA 并使用 NanoDrop2000 核酸微量定量仪对 RNA 浓度定量,使用 2 g 总 RNA 进行 cDNA合成,具体步骤按照 RevertAid First Strand cDNA 反转录试剂盒说明书所述。反转录完成后,将得到的cDNA 稀释 10 倍用于实时荧光定量 PCR 实验,qPCR 仪中热循环条件为:95 加热 2 min,95 解旋15 s,60 下20 s 退火,72 延伸20 s,变性循环共 40 次。最终表达量通过 2-CT值法进行计算分?析。实验中,GAPDH为内参基因,每个样品设置 3?个平行复孔。以上基因的引物序列均基于 GenBank网站中的 Primer-BLAST 功能设计而得,正式实验前所有引物均已进行过引物验证,效率在 0.9 1.1之间。所有引物由生工生物科技公司(北京)合成。引物序列信息如下:人AChEH(NM_000665.5)引物序列是 5-AGT ACG TTA GTC TGG ACC TGC G-3和 5-GGT GGC GCT GAG CAA TTT GG-3,人GAPDH(NM _001256799.3)引物序列是 5-ATG?ACC CCT TCA TTG ACC-3和 5-GAA GAT GGTGAT GGG ATT TC-3。1.7 数据统计单因素方差分析和动力学评估采用 GraphPadPrism 程序(7.0 版,美国加利福尼亚州圣地亚哥),并使用 Bonferroni 校正进行统计分析。数据以(平均值标准误)表示,每个实验 3 个独立生物学重复,P0.05 被认为具有统计学差异。2 结果(Results)2.1 苯线磷和甲胺磷对 TF-1 细胞活力的影响在苯线磷(10-710-3mol L-1)或甲胺磷(10-710-4mol L-1)处理 24 h 后进行 CCK-8 检测。与溶剂对照相比,在 10-4mol L-1和 10-3mol L-1的苯线磷处理后,细胞活力分别降低了约 65%和15%(图1(a)。然而,所有甲胺磷处理组中细胞活力没有显著改变(图 1(b)。使用流式细胞术进一步分析了 10-4mol L-1和10-3mol L-1苯线磷对细胞的影响。用 10-4mol L-1苯线磷处理细胞 24 h 后,凋亡细胞的百分比没有变化,而坏死细胞的百分比略有下降(图 2)。然而,凋亡和坏死细胞的百分比在用 10-3mol L-1苯线磷处理后显著增加(图 2)。2.2 苯线磷和甲胺磷对 TF-1 细胞裂解液中 AChE活性的影响 为明确苯线磷和甲胺磷是否与 TF-1 中 AChE在体外直接作用,将2 种 OPs 分别混合到 TF-1 细胞图 1 苯线磷(a)和甲胺磷(b)对 TF-1 细胞活力的影响注:不同浓度的苯线磷(a)或甲胺磷(b)或 0.05%DMSO(VV,二甲基亚砜为溶剂对照)处理 TF-1 细胞,24 h 处理后,收集细胞进行 CCK-8测定;具体实验步骤见“材料与方法”的相关内容;数据为对照组的百分比,用平均值标准误(n=3);所有样品进行 3 次独立重复实验;统计分析方法为单因素方差分析和 Bonferroni 多重比较(*表示与对照组之间存在统计学差异,显著性水平为*P0.001)。Fig.1 Effects of fenamiphos(a)and methamidophos(b)on the cell viability of TF-1 cellsNote:TF-1 cells were incubated with fenamiphos(a)or methamidophos(b)at different concentrations as indicated,or 0.05%DMSO(VV,solvent control);after the 24-h treatments,cells were collected for CCK-8 assay;see the relevant contents of“Materials andMethods”for specific experimental steps;the data are%of control group and expressed as meanSEM(n=3);all samples weremeasured in three independent experiments;statistical analysis methods were one-way ANOVA and Bonferroni multiple comparison(*indicates a significant difference between the treatment and control;the level of significance was set at*P0.001).第 4 期陈旸升等:苯线磷和甲胺磷对 TF-1 细胞乙酰胆碱酯酶影响的差异235 图 2 苯线磷对 TF-1 细胞凋亡和坏死的影响注:苯线磷(10-3mol L-1和 10-4mol L-1)或 0.05%DMSO(VV,二甲基亚砜为溶剂对照)处理细胞 24 h,通过流式细胞散点图(a)分析凋亡(b)和坏死(c)细胞;具体实验步骤见“材料与方法”的相关内容;数值为处理组凋亡细胞(b)与坏死细胞(c)与对照组相比的百分比,表示为平均值标准误(n=3),所有样品进行 3 次独立重复实验;统计分析方法为单因素方差分析和 Bonferroni多重比较(*表示与对照组之间存在统计学差异,显著性水平为*P0.001)。Fig.2 Effects of fenamiphos on apoptosis and necrosis of TF-1 cellsNote:TF-1 cells were incubated with fenamiphos(10-3mol L-1and 10-4mol L-1)or 0.05%DMSO(solvent control)for 24 h,apoptotic(b)and necrotic(c)cells were determined by flow cytometry(a);see the relevant contents of“Materials and Methods”for specificexperimental steps;values are percentage of apoptotic(a)and necrotic(b)cells and expressed as meanSEM(n=3);statistical analysismethods were one-way ANOVA and Bonferroni multiple comparison(*indicates a significant difference between the treatmentand control;the level of significance was set a*P0.001).裂解液中,然后对 AChE 活性进行定量。结果显示,孵育 1 h 和 5 h 后,所有浓度(10-710-4mol L-1)苯线磷处理组中 AChE 活性均下降,并具有剂量依赖性的抑制作用(图3(a)。其中10-4mol L-1苯线磷处理后,AChE 活性与对照组相比,在 1 h 和 5 h 分别下降大约 45%和 70%。体外孵育 1 h,苯线磷对细胞裂解液中 AChE 活性的直接抑制作用的平均 IC50值为 1.18110-6molL-1(表 1)。同时,10-6 10-5mol L-1的甲胺磷处理对 AChE 活性也有抑制作用,其中 10-5mol L-1的甲胺磷组的最大抑制率为 85%(图 3(b)。体外孵育 1 h,甲胺磷对细胞裂解液中AChE 活性的直接抑制作用的平均 IC50值为 2.83710-6mol L-1(表 1)。2.3 苯线磷和甲胺磷对 TF-1 细胞中 AChE 酶活性的影响 用对细胞活力没有影响剂量的苯线磷和甲胺磷处理 TF-1 细胞,以明确苯线磷和甲胺磷对 TF-1 细胞中 AChE 酶活性的影响。结果,在用 2 种 OPs 进行处理后,AChE 的酶活性下降,都具有剂量依赖性效应。在 10-6molL-1和 10-5molL-1苯线磷处理后,与对照相比,细胞中的 AChE 酶活性显著降低,其中10-5mol L-1苯线磷处理细胞5 h 和24 h 后,相对于对照组,AChE 活性下降大约 60%和 80%;但在用 10-7mol L-1苯线磷处理后没有明显变化(图 4(a)。此外,在 10-710-5mol L-1的甲胺磷处理后,AChE 活性同样受到抑制,其中 10-5mol L-1甲胺磷236 生态毒理学报第 18 卷处理细胞 5 h 和 24 h 后,相对于对照组,AChE 活性下降大约 50%和 65%(图 4(b)。处理 TF-1 细胞 24h,苯线磷和甲胺磷对 AChE 活性抑制作用的 IC50值分别为 1.33310-6mol L-1和 2.24910-6mol L-1(表 1)。2.4 苯线磷和甲胺磷处理对 TF-1 细胞AChE基因?表达的影响 在基因水平上进一步研究了这 2 种 OPs 对AChEmRNA 表达的影响。AChE具有不同的剪接?异构体,其中AChEH是 TF-1 细胞中AChE的主要剪图3 苯线磷(a)和甲胺磷(b)对 TF-1 细胞裂解液中 AChE 活性的影响及苯线磷(c)、(e)和甲胺磷(d)、(f)对 AChE 活性的渐进式抑制注:(a)和(b)为降低裂解液对有机磷农药(OPs)的影响,在细胞密度增加5 倍后,用磷酸钠缓冲液稀释细胞裂解液5 倍,然后用不同浓度的苯线磷和甲胺磷或0.05%DMSO(VV,二甲基亚砜为溶剂对照)处理1 h 或5 h,测定 AChE 活性,AChE 酶活性使用 Ellman 法进行测定,数值为各处理组与对照组的百分比,表示为平均值标准误(n=3),所有样品进行3 次独立重复实验;统计分析方法为单因素方差分析和Bonferroni 多重比较(*与处理时间为1 h 的对照组相比存在统计学差异,显著性水平为*P0.01,*P0.001;#与处理5 h 的对照组相比存在统计学差异,显著性水平为#P 0.01,#P0.001;与处理时间为1 h 的处理组相比存在统计学差异,显著性水平为 P0.001)。Fig.3 Effects of fenamiphos(a)and methamidophos(b)on AChE enzymatic activity in TF-1 cells lysateand progressive inhibition of human AChE with fenamiphos(c),(e)and metamidophos(d),(f)Note:(a)a nd(b)In order to reduce the effect of lysates on pesticides,cell lysates were diluted 5 times with sodium phosphate buffer after increasingcell density 5 times,and then incubated with different types and concentrations of organophosphorus pesticides(OPs)or 0.05%DMSO(solventcontrol)for 1 h or 5 h,AChE enzymatic activity was measured using the Ellman assay;values are expressed as meanSEM(n=3);*P0.01,*P0.001 compared with the DMSO groups with treatment time of 1 h;#P0.01,#P0.001 compared with DMSO groups treated for 5 h;P0.001 compared with the treatment groups with treatment time of 1 h(one-way ANOVA with Bonferroni test).第 4 期陈旸升等:苯线磷和甲胺磷对 TF-1 细胞乙酰胆碱酯酶影响的差异237 图4 苯线磷(a)和甲胺磷(b)对 TF-1 细胞中 AChE 活性的影响注:将 TF-1 细胞接种到6 孔板中,用不同浓度的苯线磷(a)和甲胺磷(b)或0.05%DMSO(VV,二甲基亚砜为溶剂对照)处理细胞;在处理一定时间后,收集细胞用于 Ellman 测定;数值为各处理组与对照组的百分比,表示为平均值标准误(n=3),所有样品进行3 次独立重复实验;统计分析方法为单因素方差分析和 Bonferroni 多重比较;*与5 h 对照组相比存在统计学差异,显著性水平为*P0.05,*P0.01,*P0.001;#与24 h 对照组相比存在统计学差异,显著性水平为#P0.01,#P0.001。Fig.4 Effect of fenamiphos(a)and methamidophos(b)on AChE enzymatic activity of TF-1 cellsNote:TF-1 cells were seeded into 6-well plates and incubated with different types and concentrations of organophosphorus pesticides or 0.05%DMSO(solvent control);after treatment for certain time,cells were collected for the Ellman assay;values are expressed as meanSEM(n=3);*P0.05,*P0.01,*P0.001 compared with the control groups with treatment time of 5 h;#P0.01,#P0.001 compared withcontrol groups treated for 24 h(one-way ANOVA with Bonferroni test).表1 苯线磷和甲胺磷对细胞裂解液中和 TF-1 细胞中 AChE 活性抑制的 IC50值以及人 AChE 的抑制常数Table 1 The IC50values of AChE in lysate and TF-1 cells and inhibition constants for human AChEIC50/(mol L-1)1裂解液 AChE(Lysate AChE)1 hIC50/(mol L-1)1细胞 AChE(Cell AChE)24 hki/(mol L-1 min-1)2hAChE 1 h苯线磷 Fenamiphos1.18110-66.910-71.33310-61.7510-83 980260甲胺磷 Methamidophos2.83710-62.42510-72.24910-63.9510-82 760360注:1IC50表示 AChE 酶活性一半时的抑制浓度,其值表示为平均值标准误;2ki表示人 AChE 酶活性抑制常数,抑制作用越强ki越小。Note:1IC50represents the inhibitory concentration for half of AChE enzymatic activity,and values are expressed as meanSEM;2kirepresents the inhibito-?ry constant of human AChE enzyme activity,and the stronger the inhibitory effect,the smaller theki.接异构体。处理24 h 后,10-6mol L-1和10-5mol L-1的苯线磷上调了AChEH的表达(约为对照的 1.25 倍?和 1.3 倍),但 10-7mol L-1的苯线磷处理AChEH没?有发生明显变化(图 5(a)。然而,AChEH的表达在?10-710-5mol L-1甲胺磷处理后上调(约为对照的1.5 倍),而在更高浓度的甲胺磷(10-4molL-1)处理AChEH没有发生明显变化(图 5(b)。3 讨论(Discussion)在本研究中,发现高浓度苯线磷(10-3molL-1)处理后,TF-1 细胞活力降低,同时诱导细胞凋亡和坏死;而所有被试浓度的甲胺磷对细胞活力均没有明显影响。此外,对于 TF-1 细胞裂解液中的 AChE,苯