S100A4基因载体的构建及其在人胃癌细胞系中的表达.pdf

2023,27(19):7-11.实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in PracticeS100A4基因载体的构建及其在人胃癌细胞系中的表达余海涛，陈正徐，谢扬虎，张飞？（1.安徽医科大学附属合肥医院检验科，安徽合肥，2 30 0 41；2.上海交通大学附属新华医院普外科，上海，2 0 0 0 9 2）摘要：目的克隆S100A4cDNA，构建pcDNA3.1-S100A4重组表达载体，转染胃癌细胞系MKN1，观察S100A4在胃癌细胞中的表达情况。方法Trizol 法提取人胃上皮细胞GES-1的总RNA，逆转录反应获得含S100A4基因的cDNA。聚合酶链反应GenBank获得 S100A4基因序列，并设计引物，利用聚合酶链反应（PCR）扩增出分子量为32 7 bp的产物。构建pMD18-Tsimple-S100A4重组质粒，转化JM109菌。菌液测序成功后，提取质粒，进行BamHI/Hind 双酶切，酶切产物回收纯化，连接表达载体pcDNA3.1，构建pcDNA3.1-S100A4真核表达载体。利用脂质体介导转染方法将纯化的表达载体转染到胃癌细胞系MKN1中,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染后MKNI细胞中 S100A4mRNA表达水平。结果PCR产物连接克隆载体的测序结果与GenBank 公布的无突变序列一致，Hind/Ba m H I 双酶切可以成功构建真核表达载体pcDNA3.1-S100A4；在胃癌细胞系MKN1中转染pcDNA3.1-S100A4表达载体，以转染pcDNA3.1空载体和正常未转染的MKN1细胞作为对照。结果表明，转染pcDNA3.1-S100A4表达载体48 h后，S100A4mRNA表达水平升高，差异有统计学意义（P 0.0 1）。结论构建完成pcDNA3.1-S100A4真核表达载体，S100A4基因在胃癌细胞MKN1中成功表达。关键词：真核载体；胃癌；基因转染；S100A4基因中图分类号：R735.2；R39 4.2 文献标志码：A文章编号：16 7 2-2 3532 0 2 3）)19-0 0 7-0 5DOI：10.7 6 19/j c mp.2 0 2 319 0 3Construction of S100A4 gene vector and its expressionin human gastric cancer cellsYU Haitao,CHEN Zhengxu,XIE Yanghu,ZHANG Fei?(1.Department of Laboratory,Hefei Hospital Affliated to Anhui Medical University,Hefei,Anhui,230041;2.Department of General Surgery,Xinhua Hospital Afiliatedto Shanghai Jiaotong University,Shanghai,200092)Abstract:Objective To clone S100A4 cDNA and construct pcDNA3.1-S100A4 recombinantexpression vector,transfect gastric cancer cell line MKN1,and observe the expression of S100A4 ingastric cancer cells.Methods Total RNA of human gastric epithelial cells GES-1 was extracted byTrizol method,and cDNA containing S100A4 gene was obtained by reverse transcription reaction.Thesequence of SI00A4 gene was obtained from GenBank by polymerase chain reaction(PCR),andprimers were designed to amplify the product with a molecular weight of 327 bp.The pMD18-T sim-ple-S100A4 recombinant plasmid was constructed to transform JM109 bacteria.After the bacterial so-lution was sequenced successfully,the plasmid was extracted for double enzyme digestion by BamH IHind II,and the enzyme digestion products were recovered and purified,and the expression vectorpcDNA3.1 was connected to construct PCDNA3.1-S100A4 eukaryotic expression vector.The purifiedexpression vector was transfected into gastric cancer cell line MKN1 by liposome mediated transfectionmethod.The expression level of S100A4 mRNA in transfected MKN1 cells was detected by reversetranscription polymerase chain reaction(RT-PCR).Results The sequencing results of the clonedvector linked with PCR products were consistent with the mutation-free sequence published by Gen-Bank,and the eukaryotic expression vector pcDNA3.1-S100A4 could be successfully constructed by收稿日期：2 0 2 3-0 6-13基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（8 18 0 2 357）通信作者：陈正徐，E-mail：40 137 7 6 48 q q.c o m修回日期：2 0 2 3-0 7-2 78double enzyme digestion of Hind II/BamH I;pcDNA3.1-S100A4 expression vector was transfectedinto gastric cancer cell line MKN1,and transfected empty pcDNA3.1 vector and normal untransfect-ed MKN1 cells were used as controls.The results showed that the expression level of S100A4 mRNAwas increased 48 h after transfection with pcDNA3.1-S100A4 expression vector(P 0.01).Con-clusion The eukaryotic expression vector pcDNA3.1-S100A4 is constructed,and S100A4 gene issuccessfully expressed in gastric cancer cell MKN1.Key words:eukaryotic vector;gastric cancer;gene transfection;S100A4 gene胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一。胃癌的主要治疗方法是手术和辅助化疗，但传统化疗副作用大，需要开发新的辅助治疗方法。研究胃癌发生发展的分子生物学机制，寻找新的靶点，将有助于开发更有效的诊断和治疗方法。近年来，S100蛋白家族越来越受到人们的关注，多个S100成员在肿瘤中表达异常,并与肿瘤的浸润和转移密切相关。文献1I报道，S100A2、S10 0 A 4、S100A6 和 S100A14 与各种恶性肿瘤的发病和进展有关。S100A4蛋白是S100蛋白家族的成员，分子量约为 11 kDa，由10 1 个氨基酸组成。S100A4在许多人类肿瘤中都有表达,其表达与胃癌的侵袭和淋巴结转移密切相关,但S100A4基因在胃癌中的作用机制尚不清楚。本研究拟通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR）与基因重组技术构建重组真核表达载体pcDNA3.1-S100A4，然后转染胃癌细胞系 MKN1，本研究为进一步探讨S100A4对胃癌细胞生物学功能的影响及其在胃癌发病中的作用奠定了实验基础。1材料与方法1.1实验材料人胃黏膜上皮细胞系CES-1、人胃癌细胞系MKN1（安徽医科大学病理学研究室购买）、克隆载体pMD18-TsimpleVector、限制性核酸内切酶、大肠杆菌JM109感受态细胞和胶回收纯化试剂盒（均为Takara公司）、真核表达载体pcDNA3.1（+）、Li p o f e c t a mi n e r M 2 0 0 0 脂质体、TRIZOLReagent（均为Invitrogen公司）、反转录试剂盒（Pr o me g a 公司）、PCRKit（T IA NG EN公司）、质粒提取试剂盒（QIAgen公司）、RPMI1640培养基、胎牛血清(GIBCO 公司)。1.2实验方法1.2.1细胞培养：在37、5%CO2饱和湿度下，在RPMI1640培养基（10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、10 0 g/mL链霉素）中培养实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in PracticeCES-1 和MKN1 细胞，0.2 5%胰蛋白酶（用生理盐水配制）消化传代。1.2.2总RNA的提取：提取GES-1细胞（细胞数约2 10 个）总RNA。磷酸盐缓冲液(PBS）清洗细胞2 次,加入1 mL TRIZOL试剂；室温静置5min，加样枪吹打混匀，取1.5mLEppendorf管收集；加入0.2 mL氯仿，涡旋振荡15s，室温静置2 3min；4，12 0 0 0 转/min离心15min，将上清液转入另一支新试管；加入0.5mL异丙醇,混匀,室温静置10 min；4，12000转/min离心10 min，弃上清；加1mL75%乙醇（DEPC水配制），涡旋冲洗1次；4，7 50 0 转/min离心5min，弃上清；风干15min，将沉淀物溶于0.0 1%DEPC-H,0中,取少量进行含量和纯度检测，剩余部分保存于-70冰箱中。1.2.3cDNA的合成：采用Promega逆转录试剂盒，将总RNA逆转录到cDNA第一链上。总反应体积为2 0 L，反应体系见表1。表1cDNA合成反应体系试剂Total RNAMgCl,(25 mmol/L)Reverse transcription 10 bufferdNTP Mixture(10 mmol)Rnase Inhibitor(40 U/L)AMV Reverse Transcriptase(20 U/L)Oligo(dTis)Primer(0.5 mg/mL)Nuclease-free Bacteria-free waterTotalRNA：总RNA；M g Cl z：氯化镁；Reversetranscription：逆转录；dNTPMixture：核苷混合物；Rnase Inhibitor：核糖核酸抑制剂;AMV Reverse Transcriptase:AMV逆转录酶;Oligo（d T/s）Pr i me r:O l i g o（d T i s）引物;Nuclease-freeBacteria-freewater:无核酸酶。无菌水反转录反应条件：42 6 0 mi n -9 9 5 mi n 4 5 mi n。1.2.4PCR扩增：参照GenBank人S100A4基因cDNA序列（基因登录号：NM_011311），使用第2 7 卷剂量2.0g4.0L2.0uL2.0uL1.0 L1.0 L1.0 LUp to 20.0 L第19 期实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice9Primer3.0软件设计引物，以转逆录合成的cDNA作为模板进行PCR扩增，扩增片段长度32 7 bp。所用的引物序列如下：5-CCCAAGCTTGTCATGGCGTGCCCT-3;5-CGCGGATCCTCATTTCTTCCTGGGCT-3。PCR反应体系见表2。表2 PCR扩增反应体系试剂CDNA10 Reaction Buffer(MgCl,15 mmol/L)dNTP(2.5 mmol/L)Forward Primer(20 mol/L)Reverse Primer(20 mol/L)Taq DNA polymerase(5 U/L)Bacteria-freewatercDNA:互补 DNA;10 Reaction Buffer(MgCl,15 mmol/L):10反应缓冲液（氯化镁15mmol/L)；d NT P：核苷；ForwardPrimer：正向引物剂；ReversePrimer：反向引物；Taq DNA polymerase:Taq DNA聚合酶;Bacteria-free water：无菌水。PCR反应条件：30个循环955m in 9 530 s 58 30 s 7 2 10 m in7230 sPCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳证实,用凝胶回收试剂盒回收并纯化目的片段。1.2.5pMD18-Tsimple-S100A4构建：载体连接，反应体系（混匀，16 过夜，用于转化)见表3。表3PCR扩增反应体系试剂Ligation Solution IpMD18-T simple载体纯化DNA片段总反应体积Ligation Solution I:酶溶液 I。转化：将6 L连接产物加入6 0 L的JM109感受态大肠杆菌中，轻轻混匀，置于冰上30min。42 热休克55s，立即置于冰上，加人940LLB培养基，37 150 转/min孵育1h，取200L涂布于LB琼脂平板（含50 g/mL氨苄青霉素纸片，X-Gal，IPT G)上，37 培养过夜,筛选蓝白阳性克隆。富集测序：挑取数个白色单菌落,接种于5mL LB培养基中，37 孵育12 16 h。以2 L菌液为模板进行PCR 扩增,筛选出阳性克隆,送1mL菌液至金域检验公司测序。质粒提取：取2 mL菌悬液转移至Eppendorf管中，10 0 0 0 转/min离心2 min，弃去上清液，用质粒提取试剂盒提取质粒。取少量用于内容物纯度检测,其余在-2 0 冰箱中冷冻保存。1.2.6pcDNA3.1-S100A4的构建：重组质粒pMD18-T simple-S100A4 以 BamH I/Hind II 双酶切，反应体系见表4。表4PCR扩增反应体系试剂体积/uLPlasmid1.010 K Buffer2.5Hind II1.0BamH I1.0ddH,01.0Plasmid：质粒；Buffer：缓冲液;0.3Hind：限制性核酸内切酶；Ba m H I：引物I；18.2ddH20:去离子水。37过夜，加入1L缓冲液终止反应，放入1.2%琼脂糖凝胶电泳,回收纯化目的片段,与BamH I/Hind 双酶切的真核表达载体PCDNA3.1（+）连接，16 水浴循环过夜，转化JM109感受态细胞，铺匀所有转化液，筛选出重组克隆，提取质粒，酶切鉴定。见图1。(+)T7PCMVpcDNA3.1(+)5.4 kb体积/uL5.01.04.010.0剂量1.0 g2.0L1.0 L1.0 Lup to 20 LBCH-A-oSV40OrNeomycinCoIE1图1pcDNA3.1(+）载体质粒谱1.2.7细胞的转染：将 MKN1 细胞按2 10个/孔接种于1.5mL/孔无抗生素培养皿中，37过夜培养；将4g质粒（pcDNA3.1-S100A4/pcDNA3.1-empty）和 8 L Lipofectamin2000在无血清和无抗生素的培养基中稀释至2 50 L室温5 min;用质粒(pcDNA3.1-S100A4/pcDNA3.1-empty)转染 MKN1细胞,将质粒与 Lipofectamin2000稀释液混合，30 min室温孵育，将50 0 L混合物加人培养皿中,前后轻轻混匀；6 h后换培养液，根据增殖情况传代,收集不同时间的细胞。1.2.8RT-PCR检测S100A4基因转录水平的表达：转染后总RNA提取及cDNA第一链合成步骤同上。运用Primer3.0软件设计引物，-actin为内参对照。所用引物序列如下：S100A4：上游10.引物5-GATGTGATGGTGTCCACCTT-3；下游引物 5-ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA-3;-actin：上游引物5-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3；下游引物5-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3。反应体系同前述；反应条件：30个循环955m in 9 540 s Tm40 s7210 m i n7240 s2结果2.1RT-PCR扩增S100A4 基因片段RT-PCR扩增的产物利用1%琼脂糖凝胶电泳，可见预期的32 7 bp基因片段,见图2。实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in PracticeM500bp250bpM：D L2 0 0 0 标记；1：RT-PCR扩增S100A4基因。图2 S100A4基因RT-PCR扩增结果2.2S100A4 基因的序列测定PCR产物连接克隆载体的测序与GenBank公布序列一致,无突变（见图3）。第2 7 卷1327 bp图3pMD18-Tsimple-S100A4重组载体测序结果2.3pcDNA3.1-S100A4表达载体的构建构建的 pcDNA3.1-S100A4 载体经 Hind I/BamHI双酶切鉴定结果见图4。以上结果可以证实真核表达载体pcDNA3.1-S100A4构建成功。M122000bp500 bp250bpM;DL2000 标记；1:pcDNA3.1-S100A4;2:pcDNA3.1-S100A4载体的双酶切。图4pcDNA3.1-S100A4载体的双酶切2.4pcDNA3.1-S100A4表达载体的鉴定在胃癌细胞系MKN1中转染pcDNA3.1-S100A4表达载体,以转染pcDNA3.1空载体和正常未转染的MKN1细胞作为对照。结果表明转染pcDNA3.1-S100A4表达载体48 h后，S100A4mRNA表达水平升高,差异有统计学意义(P0.01)，见图5。M500bp250bpM：D L2 0 0 0 标记；1：未转染的正常MKN1细胞；2：转染pcDNA3.1-阴性对照；3：转染pcDNA3.1-S100A4。图5转染pcDNA3.1-S100A4表达载体的S100A4表达3 讨 论S100A4S100蛋白首先在牛脑组织中发现,这是一组小分子量的酸性蛋白质，是钙结合蛋白中最大的亚类2-3。在2 1个S100基因家族成员中，其中有15个位于染色体1q21上,其结构在进化过程中是保守的。该段染色体不稳定，易发生多染色体重组,如杂合性丢失、易位、重叠等,与免疫调节和肿瘤预后密切相关4。此外,这15个S100家族成员参与了表皮分化复合物（EDC)的形成,该复合物与上皮分化与肿瘤的形成密切相关5。S100A4蛋白作为S100蛋白家族的一员，在小鼠的转染癌基因 v-K-ras 和 v-Ha-ras 的正常细胞和成纤维瘤细胞中，S100A4在蛋白水平和mRNA123-actinS100A4第19 期水平异常高表达。S100A4在许多人类肿瘤中均有表达,研究7 发现 S100A4 在大多数早期和晚期乳腺癌组织的细胞膜、细胞质和细胞核中均有表达,因此推测S100A4可能在乳腺癌的发生发展中起作用。研究8 证明，S100A4在正常胰腺组织、胰腺良性病变和胰腺癌组织中的表达各不相同,在胰腺癌组织中的表达水平最高。RT-PCR检测发现，有9 5%的胰腺癌细胞S100A4呈过表达，免疫组化分析证实S100A4蛋白在胃癌、甲状腺癌等肿瘤组织中高表达9-10 1目前,基因研究的热点不仅包括序列结构,还包括表达调控和功能。分子克隆中常用的携带外源基因的载体主要包括：病毒类与非病毒类的真核表达载体 。本研究通过RT-PCR获得全长S100A4 基因。DNA测序结果表明,该基因产物序列与GenBank中S100A4的编码序列完全吻合。采用基因重组技术将 S100A4基因插入 pcDNA3.1载体中，构建真核表达载体pcDNA3.1-S100A4。双酶切鉴定证实目的基因片段插人到载体的相应位置,证明重组质粒pcDNA3.1-S100A4构建成功。其构建有助于通过细胞转染手段,将S100A4导人细胞内,让S100A4 在胃癌细胞中高度表达,为了更深人研究S100A4蛋白对胃癌细胞增殖、侵袭和调亡的影响奠定了基础。本研究中,在胃癌细胞系MKN1 中转染cDNA3.1-S100A4表达载体,以转染pcDNA3.1空载体和正常未转染的MKN1细胞作为对照。结果显示，pcDNA3.1-S100A4表达载体转染后48 h，S100A4 mRNA 的表达水平显著增加,表明构建的(上接第6 面)9张良舜，叶桦基于GEO胃癌芯片数据的生物信息学分析J现代实用医学，2 0 2 2，34（11）：140 9 1411，F0002.10唐焘，武敏，王君，等C型尼曼-匹克蛋白2 在胃癌组织中的表达及其功能初步研究J第三军医大学学报，2021,43(21):2381-2388.11 蒿花，田国祥，耿辉，等。人类基因综合分析数据库Gen-eCards的应用介绍J.中国循证心血管医学杂志，2 0 2 1,13(8):902-906.12葛继芸，姚晨，张菁，等CALB2介导的肿瘤微环境免疫细胞浸润在肝癌复发中的作用机制分析J海军军医大学学报，2 0 2 2,43(7)：7 44-7 51.13桑珍珍，杨栋梁，饶欣，等基于加权基因共表达网络分析探讨新型冠状病毒感染相关脓毒症潜在的关键基因J中国急救医学,2 0 2 3，43(5)：37 6-38 2.14何融泉.大数据先验模式构建膀胱癌非编码RNA全景图谱及SCARNA12的分子机制研究D.南宁：广西医科大学,2 0 19.15吴茜，宋兴勃，钟慧钰，等，胃癌关键基因和通路的生物信息学和功能分析肿瘤预防与治疗，2 0 2 0，33（2）：131-139.16姚志强.基于生物信息学鉴定CTSV作为膀胱癌诊断和预后的标志物及预后nomogram的构建D兰州：兰州大学，2 0 2 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