奥希替尼甲磺酸盐纯度测定方法的优化及检测方法的建立.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 14 奥希替尼甲磺酸盐纯度测定方法的优化及检测方法的建立 匡正霞 上海彩迩文生化科技有限公司，上海 201202 摘要：摘要：目的 对奥希替尼甲磺酸盐纯度测定方法进行了优化，并建立了奥希替尼甲磺酸盐的质量控制的检测方法，用于更全面的控制产品的质量。方法 经过与原有纯度测定方法的对比和确认，通过对液相色谱里准确的波长选择以及改变流动相的缓冲盐和 PH 值等方法，对奥希替尼甲磺酸盐纯度测定进行了优化，并建立了质量控制的检测方法。结果 优化后的纯度检测方法能将主成分和相关杂质有效的分离；同时建立了外观、红外鉴别、HPLC 纯度、干燥失重、重金属、溶剂残留、含量的检测方法。结论 优化后的纯度测定方法更为准确、可靠，建立的检测方法，能够有效、合理、准确的控制奥希替尼甲磺酸盐的质量。关键词：关键词：奥希替尼甲磺酸盐；纯度测定；方法优化；检测方法；建立 中图分类号：中图分类号：R91 0 引言 奥希替尼甲磺酸盐：化学名：N-(2-(2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰胺。CAS 号：1421373-66-11。结构式：如图 1 所示。图 1 奥希替尼甲磺酸盐结构式 奥希替尼甲磺酸盐成药后可以用于成人患者非小细胞转移性肺癌的治疗，并且它会减少高血糖、胃肠道及皮肤不良反应发生的风险，是一种非常具有前景的新型药物。所以根据市场需求对该产品进行研究。随着对该产品的研究的不断深入，特别是对合成工艺的不断改进，杂质控制显得至关重要。关于相关检测方法的报告很少，需要一个稳定可靠灵敏的检测方法来控制产品的质量。通过研究发现客户提供的纯度测定方法色谱峰拖尾，峰高很低，很难判断产品和杂质，本研究针对上述发现的问题，对纯度测定方法进行了优化，同时建立了奥希替尼甲磺酸盐检测方法。1 仪器与试药 仪器：布鲁克核磁共振波谱仪；赛默飞 ICAP RQ 型电感耦合等离子体质谱;安捷伦1260高效液相色谱仪；岛津 UV-1800 型紫外可见光分光光度计；岛津IRAffinity-1 型红外光谱仪；岛津 GC-2010 型气相色谱仪。奥希替尼甲磺酸盐对照品（自制，批号：CVF12Z-1-A76465)；奥希替尼甲磺酸盐原料药（自制，批号：CVF12Z-1-20190901)；醋酸钠（分析纯）；冰醋酸（分析纯）；乙腈（色谱纯）。2 方法与结果 2.1 纯度测定方法的优化 2.1.1 色谱条件 以原有纯度检测方法为基础（见表 1），该条件下产品的峰型后拖且杂质分不开。对该方法进行优化。表 1 原有纯度检测方法 色谱柱 C18 4.6*150mm*4um 或等效柱 波长（nm）230 柱温()30 流速（ML/MIN）1.0 稀释剂 乙腈：水=50:50 样品溶度 0.2mg/ml 进样量 20ul 流动相 A：乙腈：水：三乙胺=5:95:0.5 B：乙腈：水：三乙胺=95:5:0.5 梯度 0-10 分钟,流动相 A 比例：90%-80%；10-20 分钟,流动相 A 比例：80%-60%；20-25 分钟,流动相 A 比例：60%-20%；25-30 分钟,流动相A 比例：20%-20%；30-35 分钟,流动相 A 比列：20%-90%中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 15 2.1.2 色谱条件优化 首先，通过产品红外和核磁中的官能团结构，大概确定一下产品的极性。其次，通过产品的紫外图谱（见图 2），发现产品在 210nm、230nm、270nm、310nm 左右均有吸收，结合产品的官能团，考虑相关杂质均是苯环主体结构，选择苯环的最大吸收波长 254nm 附近的270nm 作为液相色谱条件的检测波长。图 2 奥希替尼甲磺酸盐紫外色谱图 2.1.3 色谱柱的选择 考虑后续工厂放大检测色谱柱的普遍性及条件优化的全面性，同时参考药典中甲磺酸盐检测均采用 C18柱，结合以往色谱柱型号的参考以及杂质的分离效果，选择常用 C18-4.6*150mm*3um 色谱柱。2.1.4 流动相的优化 在产品的结构正确，波长和色谱柱确定的条件下，开始对产品的流动相进行系统的研究。客户的流动相是乙腈-水-三乙胺的碱性体系，PH 在 10-11，超过了大部分常规色谱柱 PH 的适用范围。结合产品是偏酸性的特点，从改变 PKa 下手，因为奥希替尼的 PKa 分别在 5 和 9 左右，结合酸性条件下奥希替尼容易分解，而碱性条件下，色谱柱不耐受，所以用酸性缓冲盐的体系，将流动相中的水换成 0.01mol/l 醋酸钠的缓冲盐体系，将 PH 调成 6.0，并将梯度做了相应的调整（具体条件见表 2）。按照表 2 的液相色谱参数条件，对供试品和杂质进行分离检测。（见图 3）图3中的产品的峰型和杂质的分离度均符合药典要求，确定该方法为奥希替尼甲磺酸盐的纯度检测方法。表 2 优化后的液相色谱参数表 色谱柱 C18 4.6*150mm*3um 波长(nm)270nm 柱温()30 流速（ml/min）1.0 稀释剂 乙腈：水=50:50 样品溶度（mg/ml）0.2 进样量 20ul 流动相 A：0.01mol/l 醋酸钠（醋酸调PH=3.0）B：乙腈 梯度 0-5min,流动相 A 保持 90%；5-20min,流动相 A 90%-30%；20-30min,流动相 A 30%-30%；30-30.01min,流动相 A 30%-90%；30-35min,流动相 A 90%-90%2.1.5 样品测定 图中 F12Z-1 为奥希替尼甲磺酸盐，F12Z-0X,F12Z-1X 和F12Z-2X 分别为工艺路线中的相关杂质 图 3 奥希替尼甲磺酸盐和杂质分离的色谱图 2.2 检测方法的建立2 2.2.1 外观检测 该产品是固体，所以采用目测法。取约 100mg 左右产品置于洁净滤纸上，观察其颜色及性状，应为淡黄色固体。2.2.2 红外鉴别检测 该产品是固体，参考中国药典，选择常规的采用溴化钾压片。首先称取约 400mg 干燥后的溴化钾先用玛瑙研钵研磨均匀，再用压片机压片后放入红外仪中进行扫描得溴化钾空白片的红外图谱。然后分别称取干燥后的溴化钾约 400mg、对照品约 2mg（质量比为 200:1）用玛瑙研钵研磨均匀后，用压片机压片后放入红外仪中进行扫描得对照品的红外图谱。最后分别称取干燥后的溴化钾约 400mg 和供试品约 2mg（质量比为 200:1）中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 16 用玛瑙研钵研磨均匀后，用压片机压片后放入红外仪中进行扫描得供试品的红外图谱。扣除溴化钾空白后，供试品红外图谱与对照品图谱特征峰应一致。2.2.3 纯度检测 方法见 2.1.4 中优化后确定的方法。2.2.4 干燥失重检测 产品里含有的水分和挥发性物质会影响产品的质量和含量，必须对其进行控制，通过对产品的结构以及强降解试验高温下的数据分析，产品在高温下破坏情况不明显，所以参考中国药典干燥失重法：称取 1.0g以上的产品，转入已经 105干燥过 3 小时并恒重的已称重（W1）过的称量皿中，称量得称量皿和样品的重量（W2），将样品分散均匀，放在干燥箱内 105干燥至恒重。然后称重干燥称量皿和样品的重量（W3），按照下面计算方法计算干燥失重检测结果。%LOD=W2 W3W2 W1 100（W1-称量皿的重量；W2-烘前的瓶和样品的重量；W3-烘后的瓶和样品的重量）2.2.5 重金属检测 因为产品的生产工艺的开发和不断改进，过程中用到金属催化剂，需要对产品的金属含量进行定量控制，所以选择电感耦合等离子体质谱法检测重金属的含量。开发的方法如下：精密称取 100mg 待测样品于消解罐中，加入 5ml 的 60%-65%的硝酸，然后放入消解仪中消解，消解完成后进行充分冷却，然后转移至100ml 容量瓶中，用 2%溶度的硝酸溶液润洗消解罐 3次后转移至容量瓶中，用 2%的硝酸定容后用 ICP-MS 电感耦合等离子体质谱仪检测重金属含量（具体检测金属种类见表 3）。表 3 奥希替尼甲磺酸盐金属种类表 金属种类 Li V Cr Co Ni Cu As Se Ag Cd Ba Hg Tl Pb Ru Pd Ir Pt 2.2.6 炽灼残渣检测 生产工艺中使用了无机盐，未除尽会影响产品的含量，必须控制炽灼残渣的含量。该产品理化性质上并无特殊性，采用中国药典中常规的方法如下：取本产品l.0 g，精确称量后放置于坩埚中，然后缓缓炽灼直至完全炭化后放冷；加入（0.51.0ml）的浓硫酸使炭化物全部湿润，在电炉上加热，直到硫酸蒸气消失，再在700-800炽灼至恒重。计算公式：炽灼残渣%=M3 M1M2 100%(M1 为空坩埚重量，g：M2 为样品称样量，g；M3 为灼烧后样品与坩埚恒重质量，g）2.2.7 残留溶剂的检测 该产品合成过程中使用的溶剂种类比较多，二类溶剂和三类溶剂都有涉及3。为了控制产品中的残留溶剂含量，确保其安全性，防止残留溶剂对人体健康造成伤害，所以对产品中的残留溶剂含量进行监测。为了确保涉及的和可能影响到的常规溶剂均被定量检测到，特选择了 20 种常规溶剂进行方法开发的定量分析。根据ICH(The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use)和中国药典中的有关规定4，建立灵敏度高、准确度高、稳定性好的毛细管气相色谱检测方法（具体方法见表 4）。表 4 奥希替尼甲磺酸盐溶剂残留检测仪器参数 检测器 氢火焰检测器.色谱柱 30m0.53mm3um 气相柱(DB-624)色谱所用载气 氮气 柱温箱条件 起始温度 40 度保持 18 分钟，以 40 度每分钟的速率升温到 220 度，保持 5分钟 进样器温度 250 度 检测器温度 250 度 标样溶液准备：分别准确称取所有涉及的相关溶剂各 50mg 左右到 50ml 容量瓶中，加入稀释液甲基吡咯烷酮稀释至刻度后摇匀，移取 1ml 的溶液至另一个50ml 容量瓶中,再加入甲基吡咯烷酮稀释至刻度线后摇匀，移取 5ml 该溶液至顶空瓶中摇匀进样。测试样品溶液准备：准确称取 50 mg 左右样品到5ml 容量瓶中，加入稀释液甲基吡咯烷酮稀释至刻度后摇匀进样。过程：分别进样相同体积的标样溶液和测试样品溶液，进行色谱测试，记录色谱图，测定各个峰的响应值，按照外标法计算各种溶剂残留。要求每两峰之间的分辨率是至少 1.0,相对标准偏差不超过 1.5%。计算各个溶剂的含量：PPM=AT X CRAR X CT 106（其中，AT-待测试样品峰面积平均值，AR-标准样品峰面积平均值，CT-待测试样品浓度平均值，CR-标准中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 17 样品浓度平均值）按照以上条件进行检测得到色谱图(见图 4),如图4 所示，所有溶剂均正常出峰，而且系统适应性符合要求，保证了溶剂残留所有溶剂结果的准确性。图 4 奥希替尼甲磺酸盐溶剂残留色谱图 2.2.8 含量检测（1）色谱条件：采用表2优化后的纯度检测方法，使用 Inertsil ODS-3，150mm*4.6，粒径 3um 色谱柱。（2）溶液配制 对照品溶液：精密称取奥希替尼甲磺酸盐对照品约 10mg 左右于 50ml 容量瓶中，然后加稀释剂溶解稀释后摇匀即得。供试品溶液：精密称取奥希替尼甲磺酸盐供试品约 10mg 左右于 50ml 容量瓶中，然后加稀释剂溶解稀释后摇匀即得。（3）检测限（LOD）及定量限（LOQ）按照信噪比 S/N 为 3 确定方法的 LOD 为 0.001ug,按照信噪比 S/N 为 10 确定方法的 LOQ 为 0.003ug。（4）准确度试验 分别配制 80%、100%、120%溶度水平的供试品溶液，每个溶度平行测定三份，外标法计算回收率和 RSD。9份的回收率分别为 99.41%、98.91%、99.09%、99.00%、98.44%、99.50%、99.16%、99.09%、98.98%。RSD（n=9）为 0.21%，小于 2.0%。（5）中间精密度试验 二名分析员分别按照上述奥希替尼甲磺酸盐对照品溶液配制方法和供试品溶液配制方法配制(1 份对照品溶液，2 份供试品溶液）。测定系统适用性的 RSD 结果分别为 0.17%和 0.25%，小于 2.0%。外标法计算四份供试品溶液含量分别为 99.00%、98.44%、98.35%、98.33%。含量结果的 RSD 为 0.32%（n=4），小于 2.0%。（6）重复性试验 按照上述奥希替尼甲磺酸盐对照品溶液配制方法和供试品溶液配制方法配制（1 份对照品溶液和 6 份供试品溶液）。外标法计算 6 份供试品溶液含量分别为98.55%、98.27%、99.30%、99.02%、99.48%、99.13%。含量结果的 RSD 为 0.46%（n=6），小于 2.0%。3 讨论 通过奥希替尼甲磺酸盐纯度检测条件优化后得到的色谱图（图 3）可知，相对于之前的纯度检测条件，优化后的检测方法峰型正常，奥希替尼甲磺酸盐中的杂质都能达到合理的分离效果。确定了纯度的检测方法，可以准确的控制杂质的质量，也为含量测定方法的建立提供了参考。通过对检测方法的建立，确定了奥希替尼甲磺酸盐质量控制中外观、红外鉴别、HPLC 纯度、干燥失重、重金属、溶剂残留、含量的检测方法，为准确有效的控制奥希替尼甲磺酸盐质量提供依据。综上所述虽然在检测方法建立的过程中具有较多的影响因素，且面临的问题复杂，需从多方面进行考虑。但是通过不断地尝试和优化后，最终得到了更有效、合理、准确的奥希替尼甲磺酸盐检测方法，有效地控制了该产品的质量。参考文献 1冯静,唐春雷,惠人杰.气相色谱法测定奥希替尼中溶剂残留量J.沈阳药科大学学报,2019(7):131-132.2国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部M.北京:中国医药科技出版社,2015.3潘云雪,杨直.最新美国药典通则中残留溶剂检测J.中国药品标准,2009(4):4.4周海钧.ICH 药品注册的国际技术要求:质量部分M.北京:人民卫生出版社,2006.作者简介：作者简介：匡正霞（1983），女，汉族，江苏建湖人，本科，QA 经理，研究方向为生物医药。