血液病基因检测的临床意义医学PPT课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,髓细胞系恶性肿瘤,根据细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学以及临床特征,WHO,分型法将髓系肿瘤分为,骨髓增生性疾病（,MPD,）（肿瘤，,MPN,）,骨髓增生异常,/,骨髓增生性疾病（肿瘤）,（,MDS/MPD,MDS/MPN,）,骨髓增生异常综合征（,MDS,）,急性髓细胞白血病（,AML,）,四 大 类,PH,染色体,t(9;22)(q34;q11),BCR/ABL,阳性 的慢性髓系白血病（,CML,）,慢性中性粒细胞白血病（,CNL,）,慢性嗜酸粒细胞白血病,/,高嗜酸粒细胞综征 （,CEL/HES,）,真性红细胞增多症（,PV,）,慢性原发性骨髓纤维化（伴髓外造血）（,CIMF,）,原发性血小板增多症（,ET,）,不能分类骨髓增生性疾病,七 类,骨髓增生性肿瘤（,MPN,）,骨髓增生异常,/,骨髓增生性肿瘤 （,MDS/MPN,）,是一种克隆性造血干细胞疾病，特点表现为,MDS,与,MPD,交叠，有多种,“,有效,”,造血及病态造血存在。,慢性粒,-,单核细胞白血病,（,CMML,）,不典型慢性髓系白血病,（,aCML,）,幼年型粒,-,单核细胞白血病,（,JMML,）,不能分类的,MDS/MPD,四 类,骨髓增生异常综合征（,MDS,）,MDS,也是克隆性疾病，以无效造血为其特征引起血细胞减少，骨髓及血象一至多系细胞病态造血。,MDS,亚型分类,亚型 外周血象 骨髓象,1.,难治性贫血 贫血；未见或罕见,仅红系增生异常，,（,RA,）原始细胞 原始细胞,5%,，,环形铁粒幼细胞,15%,2.,难治性贫血伴贫血；未见或罕见,仅红系增生异常，,环形铁粒幼细胞原始细胞 原始细胞,5%,，,（）环形铁粒幼细胞,15%,3.,难治性血细胞减少 血细胞减少（二系或 二系或多系细胞增生异常,伴多系增生异常 全系）；未见,Auer,小体；,10%,；原始细胞,5%,，,（,RCMD,）未见或罕见 原始细胞；未见,Auer,小体；,单核细胞,110,9,/L,环形铁粒幼细胞,15%,4.,难治性血细胞减少 血细胞减少（二系或 二系或多系细胞增生异常伴多系增生异常和 全系）；未见,Auer,小体；,10%,；原始细胞,5%,，环形铁粒幼细胞 单核细胞,110,9,/L,未见,Auer,小体；,（,RCMD-RS,）环形铁粒幼细胞,15%,亚型 外周血象 骨髓象,5.,难治性贫血伴 血细胞减少，一系或多系细胞增生异常；,原始细胞增多,1,型 原始细胞,5%,原始细胞,5%9%,；,（,RAEB-1,）未见,Auer,小体；未见,Auer,小体；,单核细胞,110,9,/L,6.,难治性贫血伴 血细胞减少，一系或多系细胞增生异常；,原始细胞增多,2,型 原始细胞,5%19%,原始细胞,10%19%,；,（,RAEB-2,）,Auer,小体（,）；,Auer,小体（,）；,单核细胞,110,9,/L,7.,未归类的,MDS,血细胞减少，单一髓系细胞增生异常；,（,MDS-U,）未见或罕见原始细胞；原始细胞,5%,；,未见,Auer,小体；未见,Auer,小体；,8.5q-,综合征 贫血；少叶核巨核细胞正常或增多；,del,（,5q,）,血小板计数正常或增高；原始细胞,5%,；,原始细胞,5%,；细胞遗传学检测仅见,del,（,5q,）异常；,未见,Auer,小体；,AML,是髓系原始细胞克隆性增生疾病，,WHO,分型将,AML,分为：,1.,伴有特殊染色体的,AML,2.,伴有病态造血的,AML,3.,治疗相关的,AML,和,MDS,4.,不伴特殊细胞遗传易位的,AML,四亚型。,急性髓细胞白血病（,AML,）,1,伴有特殊细胞遗传易位的,AML,（,1,）伴有,t(8;21)(q22;q22)AML,AML1,（,CBF,）,/ETO,的,AML,（,2,）伴有,inv(16)(p13;q22),或,t(16;16)(p13;q22),CBF/MYH11,的骨髓嗜酸粒细胞增多的,AML,（,3,）伴有,t(15;17)(q22;q11-12),PML/RAR,及变异的急性早幼粒细胞白血病（,APL,）,（,4,）伴有,11q23(MLL),异常增生的,AML,2,伴有多系血细胞增生异常的 急性髓细胞白血病,（,1,）由,MDS,或,MDS/MPD,转化而成,（,2,）发病前无,MDS,病史,3,治疗相关的,AML,和,MDS,（,1,）与烷化剂相关,（,2,）与拓扑异构酶,抑制剂相关 （一些可以是淋巴系）,（,3,）其他,4,不伴特殊细胞遗传易位的,AML,（,1,）未分化,AML,（,2,）未成熟,AML,（,3,）成熟,AML,（,4,）急性粒,-,单核细胞白血病,（,5,）急性单核细胞白血病,（,6,）急性红白血病,（,7,）急性巨核细胞白血病,（,8,）急性嗜碱细胞白血病,（,9,）伴骨髓纤维化的急性全髓增生,（,10,）髓细胞肉瘤,淋系肿瘤：,B,系肿瘤和,T/NK,细胞系肿瘤,又可分为两大类型：,前体淋巴细胞肿瘤（淋系白血病）,外周或成熟淋巴细胞肿瘤（淋巴瘤）,前者指淋巴细胞分化的早期阶段起源的肿瘤,后者是分化成熟阶段来源的肿瘤,B,细胞系肿瘤,前体,B,细胞肿瘤,前体,B,淋巴母细胞白血病,/,淋巴瘤（,B-ALL/LBL,）,成熟（周围）,B,细胞肿瘤,B-,慢性淋巴细胞性白血病,/,小淋巴细胞淋巴瘤（,B-CLL/SLL,）,B-,细胞幼淋巴性细胞白血病（,B-PLL,）,淋巴浆细胞淋巴瘤（,LPL,）,Burkitt,淋巴瘤（,BL,）,多毛细胞白血病（,HCL,）,浆细胞骨髓瘤,/,浆细胞瘤（,PCM/PCL,）,脾边缘区,B,细胞淋巴瘤，,绒毛状淋巴细胞（,SMZL,）,结外边缘区,B,细胞淋巴瘤，,MALT,型（,MALT-MZL,）,结型边缘区,B,细胞淋巴瘤，,单核细胞样,B,细胞（,MZL,）,滤泡性淋巴瘤（,FL,）,套细胞淋巴瘤（,MCL,）,弥漫性大,B,细胞淋巴瘤（,DLBCL,）,T,细胞和,NK,细胞系肿瘤,前体,T,细胞肿瘤,前体,T,淋巴母细胞淋巴瘤,/,白血病（,T-LBL/ALL,）,成熟（周围）,T,细胞肿瘤,T-,细胞幼淋巴细胞白血病（,T-PLL,）,T-,大颗粒淋巴细胞白血病（,T-LGL,）,侵袭性,NK,细胞白血病（,ANKCL,）,成人,T,细胞淋巴瘤,/,白血病（,ATCL/L,）,结外,NK/T,细胞淋巴瘤，鼻型（,NK/TCL,）,肠病型,T,细胞,/,淋巴瘤（,ITCL,）,肝脾,T,细胞淋巴瘤,皮下脂膜炎样,T,细胞淋巴瘤,蕈样真菌病,/Sezary,综合征（,MF/SS,）,间变性大细胞淋巴瘤（,ALCL,）,霍奇金淋巴瘤（霍奇金病）,结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤（,NLPHL,）,经典型霍奇金淋巴瘤,结节硬化型霍奇金淋巴瘤，,1,和,2,级（,NSHL,）,富于淋巴细胞经典霍奇金淋巴瘤,混合细胞型霍奇金淋巴瘤（,MCHL,）,淋巴细胞消减型霍奇金淋巴瘤（,LDHL,）,白 血 病 基 因 检 测,基因突变,是指由于,DNA,分子中发生碱基对的,_,而引起的,_,的改变。,增添,替换,缺失,（,D,）,（,d,1,）,（,d,2,）,（,d,3,）,增添、缺失或替换,基因结构,基因突变,一定,会导致生物性状的改变吗,?,m,RNA:,G,A,A,甲 乙 丙 丁,DNA,碱基对替换，,不一定,引起蛋白质结构的改变。,结论,:,碱基对替换,一定,会导致蛋白质结构的改变吗,?,氨基酸,:,天冬氨酸,天冬氨酸,谷氨酸,缬氨酸,G A,U,G A,C,G,U,A,1,、二战时，美国在日本的广岛、长崎投下两颗原子弹，导致白血病患者出生率增加。,2,、,苏丹红,进入人体可产生致癌作用。,3,、乙肝病毒使肝细胞进一步变异，肝细胞不凋亡，而且不断地再生，就形成了肝癌。,内因,：,DNA,复制时自身也偶尔发生错误,物理因素,化学因素,生物因素,基因突变原因：,基因突变的特点,大多数基因突变对生物体是有害的，只有少数是有利的，有些既无害也无益。,多数有害,结果：增殖过度，分化阻断，凋亡受抑,白血病的分子检测,Southern blot,Northern blot,Western blot,FISH,PCR,测序,芯片,白血病的分子检测,PCR,方法优点,快速,灵敏,特异,PCR,方法缺点,假阳性,假阴性,！,白血病的分子检测,PCR,：,仅适用于染色体断裂点丛集于相对小的范围内（,2kb,），如,T-ALL,中,SIL-TAL1,。,RT-PCR,：,可用于染色体,断裂点跨越很大的区域的融合基因。,巢式,RT-PCR,：,可显著提高反应的特异性，增加扩增效率。,RQ-PCR,：,可定量扩增产物。,白血病分子检测的临床应用,白血病的分子生物学检查对白血病诊断分型及预后判断有以下几方面意义：,补充,MIC,检查的不足,发现新的亚型,监测白血病的微小残留病灶（,MRD,）,为研究白血病的发病机制打下基础,白血病分子检测的临床应用,PCR,方法检测,MRD,常用的分子标志,AML1-ETO,t(8;21)(q22;q22),68%,原发性,AML,，在,M2,中的阳性率为,2040%,，在,M2b,中阳性率为,90%,少见于,M4,和,M1,，极少见于,MDS,和骨髓增生综合症,AML1-ETO+,白血病细胞有一定程度的分化能力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，且对,化疗反应较敏感,AML1-ETO+,患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果好,，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后较其他,AML,亚型（,M3,除外）好,AML1-ETO,对初发患者进行,t(8;21),和,AML1-ETO,融合基因的检测对其预后判断及治疗方案的制定相当重要,AML1-ETO,定性结果不能用于评价患者,MRD,情况,RQ-PCR,能实时反映体内,AML1-ETO,水平,。连续定量,AML1-ETO,转录本水平可判定有高复发风险的患者，以便及早治疗干预以防血液学复发,PML-RAR,t(15;17)(q22;q21),，,98%M3,患者阳性,继,t(15;17),之后，又先后发现,4,种,M3,特异的累及,RAR,的变异性染色体易位：,t(5;17)(q35;q21),，,t(11;17)(q13;q21),，,dup(17)(q21.3;q23),，,t(11;17)(q23;q21),分别产生,NPM-RAR,，,NuMA-RAR,和,PLZF-RAR,，,STAT5b-RAR,融合基因,临床上，具有,PLZF-RAR,或,STAT5b-RAR,融合基因患者对,ATRA,治疗不敏感，其余三种染色体易位患者经,ATRA,治疗可获完全缓解,PML-RAR,APL,累及的,RAR,基因及其伙伴基因结构示意图,PML-RAR,由于,PML,基因断裂点,不同，产生,3,种不同的,PML-RAR,异构体,约,55%,的,M3,患者为,L,型，,40%,为,S,型，,5%,为,V,型，且每位患者只表达一种,PML-RAR,融合蛋白,形态学上,S,型白血病细胞常为低分化的并且这些患者可见继发细胞遗传学异常，,V,型,APL,患者的白血病细胞体外对,ATRA,的敏感度低,PML-RAR,RT-PCR,检测,PML-RAR,是敏感且特异的,APL,诊断方法，还能用于,治疗后,MRD,监测,。,PML-RAR,阳性提示的分子复发常早于临床复发,3-6,个月，为临床采取进一步治疗措施提供了保障,RQ-PCR,能有效反映患者在发病、治疗、缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，在,MRD,监测中比,RT-PCR,具有更高价值,FLT3,基因突变,Fms-related tyrosine kinase 3,FLT3,为,III,型受体酪氨酸激酶家族（还包括,c-FMS,，,PDGFR,和,c-KIT,）成员之一，该类受体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发挥重要调控作用,据报道，,FLT3-ITD,和,D835,突变在,AML,中阳性率分别为,24%(385/1585),和,7%(30/429),，总阳性率超过,30%,，使其成为,AML,中最普遍发生突变的靶基因,许多临床研究发现，,FLT3,突变还与临床预后密切相关，尤对,60,岁以下的,AML,患者，,FLT3,突变患者预后较差，,且可独立于核型之外,CBF,-MYH11,inv(16)(p13;q22),及,t(16;16)(p13;q22),主要见于,M4Eo,，,10%,不伴异常嗜酸细胞,M4,，,少见于,M2,CBF,-MYH11,融合蛋白通过干扰核心结合因子（,core binding factor,CBF,）的转录激活作用而致病,具有,CBF,-MYH11,的患者对化疗敏感，预后较好，,故提高检测率尤具临床意义,CBF,-MYH11,CBF,-MYH11,具有多种变异型，其中最常见的为,A,型，占,80%,RT-PCR,检测,CBF,-MYH11,进行,MRD,监测显示，大部分患者在完全缓解时,PCR,转阴，但仍有小部分长期存活者,PCR,仍为阳性,最新研究采用,RQ-PCR,检测,CBF,-MYH11,转录本水平来评价,M4Eo,患者,MRD,情况，预示复发,DEK-CAN,t(6;9)(p23;q34),主要见于,M2,或,M4,，也见于,M1,，,MDS,-,RAEB,伴,DEK-CAN,的患者年龄一般较轻，且,预后较差,此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，调整治疗方案,WT-1,基因高表达,Wilms tumor 1,是无特异分子异常的急性白血病患者理想的,MRD,检测指标,伴此基因,高表达者预后差,，且表达程度与预后相关,BCR-ABL,t(9;22)(q34;q11),1530%,成人,ALL,及,35%,儿童,ALL,9,号染色体的断裂点与,CML,相同，但,22,号染色体断裂点具有异质性,此融合蛋白,p190,刺激细胞增殖的能力比,p210,要强。在转基因试验中观察到,p190,诱发的白血病具有起病早、发展快和恶性程度高的特点,BCR-ABL+,ALL,患者预后差,，,5,年存活率,20%,，因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗,BCR-ABL,对于自体或异体移植,ALL,患者，移植前后,BCR-ABL,的有无以及,BCR-ABL,的转录本类型与预后有关,E2A-PBX1,t(1;19)(q23;p13),56%,儿童,ALL,和,3%,成人,ALL,此类患者具有,高的白细胞计数，高的血清乳酸脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差,，平均无病生存期（,DFS,）仅,6,个月，,3,年,DFS,为,20%,，需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后,核型和,E2A-PBX1,检测对此类患者的诊断和治疗方案的选择至关重要,E2A-PBX1,的预后价值需更多的临床研究证实,TEL-AML1,t(12;21)(p13;q22),25%,儿童,ALL,，是儿童,ALL,中最常见的分子异常,目前为止尚未在,T-ALL,，,AML,或,NHL,中发现,t(12;21),，在婴儿白血病中极少报道，在成人白血病患者中频率很低（,2%,）,此类患者发病年龄小（,2,岁,10,岁），,WBC,计数低（,50 000/L,），,免疫表型为前,B-ALL,此类患者对,治疗反应佳,，完全缓解时间长，预后好,TEL-AML1,由于,12p,和,21q,末端在常规显带中很相似，因此常规细胞遗传学方法检出率仅,0.05%,，需应用,FISH,或,RT-PCR,方法提高检测阳性率,TEL,基因重排是独立预后因素，,RT-PCR,检测,TEL-AML1,融合基因能将低危险度与高危险度的,ALL,患者区分开来。因此早期检测,TEL-AML1,融合基因对临床预后，确定合适的治疗方案都有重要意义,MLL,相关融合基因,累及,MLL,基因的分子异常见于,5.2%AML,，,22%ALL,和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可见于治疗相关白血病，尤接受,topoisomerase II,抑制剂治疗的患者,MLL,基因涉及五十余种染色体易位,，产生不同的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血病表型相关。最常见的有：,t(4;11)(q21;q23),MLL-AF4,融合基因,ALL,t(9;11)(p22;q23),MLL-AF9,融合基因,AML,t(11;19)(p13;q23),MLL-ENL,融合基因,AML,及,ALL,MLL,相关融合基因,MLL,相关融合蛋白的致病性还不清楚，推测其可能具有双重作用：,融合蛋白可能获得新的功能，促使细胞转化,MLL,发生断裂后，缺失锌指结构域的,MLL,不能与,DNA,结合，失去其转录活化功能，使受,MLL,调节的靶基因（,HOX,基因）表达异常，也影响造血细胞的发育,MLL-AF4,t(4;11)(q21;q23),t(4;11),的发生率在不同年龄段是不同的，在婴儿,ALL,中最多见，为,5070%,，而在儿童和成人中较低，分别为,2%,和,36%,此类患者,发病年龄低（通常,90%CML,患者,BCR-ABL,融合蛋白（,p210,）的酪氨酸蛋白激酶活性较正常,ABL,高，可能是,BCR,对,ABL,激酶活性调节区的作用所致,由于,5%CML,患者为隐匿性,Ph,染色体，因此无,Ph,染色体,CML,患者还需使用更灵敏的分子检测手段如,FISH,或,RT-PCR,检测,BCR-ABL,融合基因,RT-PCR,还能区分,e1-a2,和,b2-a2/b3-a2,二种,BCR-ABL,转录本，从而区分,ALL,患者与,CML,急淋变患者，进而分别对两种不同患者采用不同的治疗方案,C M L,BCR-ABL,巢式,RT-PCR,检测,BCR-ABL,融合基因用于,CML,移植患者,移植后,MRD,监测,。可在患者血液学复发前的,624,个月骨髓检测就呈阳性。,RQ-PCR,还能动态观察患者治疗后,BCR-ABL,转录本水平变化情况，反映疗效。,GATA2,基因突变,调控早期造血干细胞增殖分化的转录因子，维持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力,CML,急变患者中新发现,GATA2,基因突变,，而,CML,慢性期、加速期，,AML,（,M1-M7,），,MDS,，,ALL,，,CLL,，,淋巴瘤和骨髓瘤患者，以及正常对照均未发现该突变，,可见,GATA2,基因突变仅与,CML,急变相关，是,CML,疾病进展过程中的获得性突变。,总发生率为,12.5%,（,5/40,）,，且均造成,CML,急粒单变,GATA2,基因,突变与,CML,患者疾病进展和预后的关系有待进一步阐明,JAK2,基因突变,Janus kinase 2,此基因突变主要见于,MPD,和,MDS,，另可存在于部分,AML,尤,M2,突变为,V617F,突变去除了,JAK2 JH2,负性调控，导致该基因的持续活化，赋予细胞增殖存活优势,JAK2,可成为靶向治疗的靶点,MDS,相关基因异常,Delta,样,(Dlk),基因编码,Dlk,蛋白在,MDS,明显增高者,55%,，而,AML,仅,10%,，,可能是,MDS,特异性基因,，但作为诊断,MDS,的标志基因尚待进一步确定,MDS,相关基因异常,RAS,此原癌基因超家族编码鸟苷三磷酸水解酶,(GTPase),调节细胞生长相关信号,ras,癌基因的活化，尤其是,N-ras,的激活可在约,35%,的,MDS,患者中发生,FMS,为集落刺激因子,1,，控制单核,-,巨噬细胞生长、分化及功能,fms,基因的突变可在,16%,的,MDS,患者中发现,ras,和,fms,突变主要见于粒,-,单细胞分化的疾病，即,MDS,中的,CMML,，患者生存期短，转,AML,多,MDS,相关基因异常,p53,在,MDS,时，,p53,突变较少见,(5%),，但在较为进展的病例中可高达,15%,p53,突变意味着化疗耐药和生存期缩短，因而是一种有意义的预后指标,FLT3,10%MDS,有,FLT3,点突变，加快进展为,AML,，但,FLT3-ITD,少见,AML1(RUNX1),为,MDS,较常见的点突变，发生率,25%,，导致核心结合因子,(CBF),亚单位正常功能缺失，易转化,AML,Ig/TCR,基因重排,Ig,的基因由,L,，,L,和,H,三个基因组组成，分别编码,L,链，,L,链和,H,链。,L,和,H,基因又由编码,Ig,分子的,V,区和,C,区基因构成。,TCR,由两条肽链组成，,链或,链，不论是哪一种肽链，其胞膜外区均包括两部分，即,V,区和,C,区。相应的编码基因为,TCRA,TCRB,TCRG,和,TCRD,。,Ig/TCR,基因重排,Ig/TCR,基因重排检测，对决定白血病的细胞来源系列乃至分化阶段，有重大意义,在,B,系,ALL,中分别有,95%,，,54%,，,55%,和,33%,的患者有,IgH,，,TCR,，,TCR,和,TCR,基因重排，,在,T-ALL,中相应的基因重排率分别为,14%,，,68%,，,91%,和,89%,由于重排的多样性，重排的,Ig,和,TCR,基因连结区序列在各淋巴,(,前体,),细胞中是不同的，因而,每位患者有其各自特异的,Ig/TCR,基因重排序列，这一特定的,Ig/TCR,基因重排序列可作为该恶性克隆的分子标志，,在分子水平进行,诊断分型,，还可通过,PCR,检测缓解期患者有无初发时的,Ig/TCR,基因重排来追踪残余白血病细胞（,MRD),，用于,预后判断,