丙二醛氧化对牦牛肉肌浆蛋白理化特性及色泽稳定性的影响.pdf

食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.16 113丙二醛氧化对牦牛肉肌浆蛋白理化特性及 色泽稳定性的影响陈腊梅，唐善虎*，李思宁，李锦锦，赵佳莹，李巧艳（西南民族大学食品科学与技术学院，四川 成都 610041）摘 要：利用不同浓度丙二醛（malondialdehyde，MDA）氧化牦牛肉源肌浆蛋白（sarcoplasmic proteins，SP），通过评价SP侧链氨基酸氧化情况、蛋白结构、色泽、肌红蛋白（myoglobin，Mb）氧化状态，探讨脂质氧化对牦牛肉SP理化特性及色泽稳定性的影响。结果表明：经过MDA氧化后，SP的a*值、b*值、C*值、脱氧肌红蛋白含量和氧合肌红蛋白含量均显著降低（P0.05），L*值、高铁肌红蛋白含量和超铁肌红蛋白浓度均显著升高（P0.05），即MDA氧化导致色泽稳定性降低。SP的羰基含量、二聚酪氨酸含量、SP-MDA加合物荧光强度、-螺旋和-转角相对含量均显著升高（P0.05），总巯基含量、表面疏水性、内源荧光强度、-螺旋和无规卷曲相对含量均显著降低（P0.05），十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示小分子条带的模糊扩展和高分子聚集物的形成，反映MDA促进了SP的氧化、聚集。Pearson相关性分析揭示了MDA氧化、SP理化性质、色泽稳定性三者之间的强相关性（P0.05）。本研究认为，MDA通过直接氧化SP和间接介导Mb氧化改变了SP结构，并导致SP交联聚集和色泽稳定性降低。关键词：丙二醛氧化；肌浆蛋白；色泽稳定性；牦牛肉Effect of Malondialdehyde Oxidation on Physicochemical Properties and Color Stability of Yak Meat Sarcoplasmic ProteinsCHEN Lamei,TANG Shanhu*,LI Sining,LI Jinjin,ZHAO Jiaying,LI Qiaoyan(College of Food Science and Technology,South West Minzu University,Chengdu 610041,China)Abstract:Sarcoplasmic proteins(SP)derived from yak meat were oxidized by malondialdehyde(MDA)at different concentrations.The effects of lipid oxidation on physicochemical properties and color stability of SP were investigated by evaluating side-chain amino acid oxidation,protein structure and color of SP and the oxidation status of myoglobin(Mb).The results showed that after MDA oxidation,the a*value,b*value,C*value,and deoxymyoglobin and oxymyoglobin contents of SP significantly decreased(P 0.05),and the L*value,metmyoglobin content,and ferrylmyoglobin concentration significantly increased(P 0.05),indicating that MDA oxidation lowered color stability.The contents of carbonyl groups and dimeric tyrosine,the fluorescence intensity of SP-MDA adducts,and the relative contents of-helix and-turn significantly increased(P 0.05),and total sulfhydryl content,surface hydrophobicity,intrinsic fluorescence intensity,and the relative contents of-helix and random coil significantly declined(P 0.05).Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)showed blurred expansion of small molecule bands and the formation of macromolecular aggregates,suggesting that MDA promoted the oxidation and aggregation of SP.Pearson correlation analysis revealed significant correlations between MDA oxidation and physicochemical properties and color stability of SP(P 0.05).This study reveals that MDA alters the structure of SP by directly oxidizing it or mediating Mb oxidation,causing cross-linked aggregation of SP and reducing its color stability.Keywords:malondialdehyde oxidation;sarcoplasmic protein;color stability;yak meatDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220730-345中图分类号：TS251.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）16-0113-08收稿日期：2022-07-30基金项目：中央高校创新团队项目（2021XJTD02）第一作者简介：陈腊梅（1998）（ORCID:0000-0002-0656-8719），女，硕士研究生，研究方向为畜产品加工与安全。E-mail:*通信作者简介：唐善虎（1964）（ORCID:0000-0002-2416-4443），男，教授，博士，研究方向为动物性食品加工与安全。E-mail:114 2023,Vol.44,No.16 食品科学 食品化学引文格式：陈腊梅,唐善虎,李思宁,等.丙二醛氧化对牦牛肉肌浆蛋白理化特性及色泽稳定性的影响J.食品科学,2023,44(16):113-120.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220730-345.http:/ CHEN Lamei,TANG Shanhu,LI Sining,et al.Effect of malondialdehyde oxidation on physicochemical properties and color stability of yak meat sarcoplasmic proteinsJ.Food Science,2023,44(16):113-120.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220730-345.http:/肉色是消费者判断肉品新鲜程度的直观指标，直接影响了消费者的购买愿望1。宰后肌肉的肉色主要取决于肉肌浆中血红素蛋白质 肌红蛋白（myoglobin，Mb）的状态，在加工贮藏过程中，肉及肉制品发生氧化，高铁肌红蛋白（metmyoglobin，MMb）逐渐累积，肉色劣变为令人难以接受的灰褐色2-3。肉及肉制品的氧化可被视为级联反应，即脂质氧化、蛋白质氧化、肌红蛋白氧化之间相互促进、相互作用4。普遍认为，脂质氧化是影响肉色稳定性的重要因素，脂质氧化程度越高，肉色稳定性越低1,5。王兆明等6研究脂质过氧自由基诱导兔肉肌浆蛋白（sarcoplasmic proteins，SP）聚集机制发现，过氧自由基不仅可以直接引发SP聚集，还可以通过介导Mb自氧化促进SP交联聚集，对肉的保水性和色泽具有重要影响。据报道，脂质氧化的次级产物比初级产物更容易与蛋白质发生作用7。如,-不饱和醛具有高反应性和稳定性，很容易在肌浆中扩散，通过共价加成与Mb反应，改变蛋白质的三级结构并使其易于进一步氧化4,8。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是肉类贮藏过程中脂质氧化次级产物中最丰富且具代表性的活性醛类之一，来源于多种不饱和脂肪酸，具有较强的诱导蛋白氧化变性能力，是脂质氧化应激的标志物9。Wang Zhaoming等10观察到MDA氧化不仅促进了兔肉源Mb的自氧化，还导致了超铁肌红蛋白（ferrylmyoglobin，Mb（IV）O）及其他活性物质的生成，从而影响兔肉品质。Bonny11研究表明MDA可能通过牛肉源氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，OMb）氧化为MMb而调控肉色。也有研究表明，脂质氧化引起的肉色变化具有物种特异性，具有高含量组氨酸残基的氧合肌红蛋白的肉类更易受到脂质氧化产物的亲核攻击12。牦牛生长在高寒低氧地区，其Mb含量高，内源性抗氧化能力强13。SP占骨骼肌总蛋白的30%，是Mb的主要存在场所；同时，SP中还含包含了多种可溶性酶类、抗氧化蛋白和物质，调控影响肉色稳定性的生化过程14-15。因此，SP一直是肉色领域的重点研究对象。然而，目前鲜见MDA氧化对牦牛肉肉色稳定性影响的报道，同时，有关肉色稳定性的研究聚焦于Mb，肉色与SP理化性质关系尚不清楚。因此，本研究构建MDA氧化体系，探讨不同脂质氧化程度下牦牛肉SP理化性质变化与色泽稳定性的关系，旨在为牦牛肉的加工与贮藏提供参考依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂牦牛肉购于四川成都双流区白家明宣鲜牛肉门市部。选取自然放牧状态下34 岁雄性健康麦洼牦牛（平均质量230 kg），经屠宰后室温下排酸6 h，随机选取2 条背长肌，用保温箱（内含冰袋，04）运回实验室（1 h），于20 冰箱内贮藏待用。2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，D N P H）、溴 酚 蓝、三 氯 乙 酸、乙 酸 乙 酯、冰醋 酸 成 都 科 隆 化 学 品 有 限 公 司；盐 酸 胍、十 二 烷 基 硫 酸 钠（s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e，S D S）、尿 素、三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷（t r i s-(hydroxymethyl)-aminomethane，Tris）德国 BioFroxx公司；考马斯R-250、考马斯-G250上海源叶生物有限公司；5,5-二硫基-2,2-二硝基苯甲酸（5,5-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、1,1,3,3-四甲氧基丙烷（1,1,3,3-tetramethoxy-propan，TMP）上海麦克林生化科技有限公司；5蛋白上样缓冲液（含二硫苏糖醇）北京索莱宝科技有限公司；宽范围彩色预染蛋白质Marker MP206天根生化科技有限公司。1.2仪器与设备PL303分析天平梅特勒-托利多国际股份有限 公司；全温振荡培养箱上海智城分析仪器制造有限公司；ALPHALSC冷冻干燥机德国Martin Christ 公司；Centrifuge 5804R高速冷冻离心机德国Eppendorf公司；UV1810S紫外分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司；F-4700型荧光分光光度计日本那珂事务所；CR-700d/600d色差仪日本Konica Minolta公司；傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）仪美国PeakinElmer公司。1.3 方法1.3.1 SP的提取参考Xue Chaoyi等16的方法并略作修改。取冷藏解冻后的牦牛肉背最长肌，剔除筋膜、脂肪后，将牦牛肉切成均匀的小块，放入绞肉机中绞碎制成直径5 mm的肉糜。取200 g牦牛肉糜按料液比1 4（g/mL）加入40 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0），10 000g匀浆1 min，浸提30 min后离心（4、4 500g、15 min），滤纸过滤，所得滤液即为SP溶液。采用双缩脲法进行测定蛋白质量浓度，并调整质量浓度为10 mg/mL。食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.16 1151.3.2 MDA氧化体系构建参考Wang Zhaoming等10的方法并略作修改。取4.2 mL TMP溶于5 mL 5 mol/L HCl溶液，纯水定容至25 mL中，40 避光水浴加热30 min，直至溶液颜色变为深黄色，冷却至室温后用6 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0，4 避光贮藏备用。将MDA稀释104 倍，在267 nm波长处测定浓度，摩尔吸光系数为 31 500 L/（molcm）。往SP溶液中加入不同体积的MDA，再加入0.02%的叠氮化钠，防止微生物生长，使MDA最终浓度分别为0、0.1、1、2、5、10 mmol/L。在4 避光振荡反应12 h，随后置于4 去离子水中透析48 h。透析袋截留分子质量7 kDa，每2 h换1 次去离子水（1.0 L/次）。最后冷冻干燥得到不同氧化程度的SP。1.3.3 SP色泽的测定色差仪采用D65光源，8 mm孔径，近似角度10，经零校正、白板校正后使用。用40 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）将SP溶解，质量浓度调至10.0 mg/mL。取适量SP溶液于直径5 cm的透明小杯中，置于白色载物板上，以载物板和透明小杯为标准去除背景影响，每个样品平行测定6 次，记录样品的亮度值（L*值）、红度值（a*值）、黄度值（b*值），并计算色饱和度（C*值）和色调角（H*值）17。C*?a*2?b*2（1）H*?tan?1a*b*（2）1.3.4 Mb氧化状态的测定参考Krzywicki18的方法并略作修改。将SP溶液稀释至5.0 mg/mL，离心（4、2 500 g、20 min），过滤上清液，取滤液分别在525、545、565、572 nm波长处测定吸光度。根据式（3）（5）计算脱氧肌红蛋白（deoxymyoglobin，DMb）、OMb、MMb的相对含量。DMb/%?0.369R1?1.140R2?0.941R3?0.015?100（3）OMb/%?0.882R1?1.267R2?0.809R3?0.361?100（4）MMb/%?2.514R1?0.777R2?0.800R3?1.098?100（5）式中：R1A572/A525，R2A565/A525，R3A545/A525。参考Wang Zhaoming等10的方法并略作修改。在410 nm波长处测定5.0 mg/mL SP溶液吸光度，根据 式（6）计算Mb（IV）O浓度。Mb?IV?O?/?mol/L?1?bA412 nm?103（6）式中：1111 L/（mmolcm）；b为比色皿光径，1 cm。1.3.5 SP羰基含量的测定参考李思宁等19的方法并略作修改。取1 mL 5.0 mg/mL SP溶液加入1 mL含0.02 mol/L DNPH的2 mol/L HCl溶液，以2 mol/L HCl溶液为对照，室温下避光反应40 min，每隔15 min振荡混匀1 次。加入预冷的1 mL 20%三氯乙酸溶液并离心（4、10 000g、5 min），除去上清液，加入1 mL 乙醇-乙酸乙酯（1 1，V/V）溶液，离心洗涤沉淀3次（4、10 000g、5 min）。加入3 mL 6 mol/L盐酸胍溶液，37 保温15 min溶解沉淀，离心（4、10 000 g、3 min）除去不溶物质，在波长370 nm处测定吸光度。以每毫克蛋白含羰基量表示（nmol/mg）。羰基含量计算公式如下：2?b?c106?A370 nm?n?/?nmol/mg?（7）式中：A370 nm为样品吸光度；n为稀释倍数（3）；222 000 L/（molcm）；c为SP质量浓度/（mg/mL）。1.3.6 SP总巯基含量的测定参考邓小蓉等20的方法并略作修改。取1 mL 5 mg/mL SP溶液，分别加入8 mL Tris-甘氨酸（含10.4 g/L Tris，6.9 g/L甘氨酸，1.2 g/L EDTA-2Na，8 mol/L尿素，pH8.0），混合后离心（4、8 000 r/min、15 min）去除不溶性蛋白，再向溶液中加入0.5 mL 10 mmol/L DTNB混合，室温下反应30 min，412 nm波长处测定吸光度。总巯基含量计算公式如下：3?b?c106?A412 nm?n?/?nmol/mg?（8）式 中：A4 1 2 n m为 样 品 吸 光 度；n 为 1 0；313 600 L/（molcm）。1.3.7 SP二聚酪氨酸含量的测定参考Davies等21的方法。将SP溶液质量浓度调至0.1 mg/mL，设定发射波长420 nm，激发波长325 nm，狭缝宽度均为10 nm，电压400 V。扫描至少6 次并记录，二聚酪氨酸含量以相对荧光强度表示。1.3.8 SP-MDA加合物荧光强度的测定参考Wang Zhaoming等10的方法。将SP溶液质量浓度调至0.5 mg/mL，激发波长390 nm，狭缝宽度均为5 nm，扫描速率1 200 nm/min，电压400 V，记录SP在400500 nm波长处的荧光扫描光谱。1.3.9 SP表面疏水性的测定参考王兆明等6方法。取1.0 mL 5 mg/mL SP溶液加入200 L 1.0 mg/mL溴酚蓝溶液，25 振荡10 min，离心（4、6 000 r/min，15 min），取上清液进行10 倍稀释，在595 nm波长处测定吸光度，以溴酚蓝结合量表示SP表面疏水性。1.3.10 SP内源荧光强度的测定参考王兆明等6的方法。将SP溶液质量浓度调至0.1 mg/mL，设定激发波长为295 nm，狭缝宽度均为10.0 nm，扫描速率为1 200 nm/min，电压400 V，记录SP在310400 nm波长处的荧光扫描光谱。116 2023,Vol.44,No.16 食品科学 食品化学1.3.11 SP的FTIR扫描参考Yang Nan等22的方法。将SP粉末放置于ATR附件上扫描，采集范围4 000650 cm1，扫描次数4 次，分辨率为4 cm1，每个样品重复扫描3 次，用Peakfit4.12软件进行分析。1.3.12 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）参考李思宁等19方法。将SP质量浓度调至1.0 mg/mL，待测样品和5上样缓冲液以体积比41混合，沸水浴5 min，冷却后离心（4、10 000g，5 min）。使用Bio-Rad电泳仪进行电泳，样品上样体积为10 L，采用12%分离胶、4%浓缩胶分离样品。电泳时，80 V电压运行0.5 h，待指示带到达分离胶上沿处将电压调至120 V，运行约1.5 h指示带到达分离胶底部，结束电泳。用0.2%的考马斯亮蓝R-250溶液染色2 h，用脱色液（含7.5%乙醇和7.5%醋酸）脱色至背景清晰。1.4 数据处理实验重复测定3 次，所有指标平行测定3 组，结果以 s表示。数据采用SPSS 24.0软件进行平均值和标准差计算、方差分析和Pearson相关性分析，使用Duncan多重比较进行组间显著性分析，P0.05，差异显著；采用Origin 2021 Pro软件作图。2 结果与分析2.1 MDA氧化对牦牛肉色泽稳定性的影响2.1.1 MDA氧化对牦牛肉SP色泽的影响色差是新鲜肉颜色变化的特征参数23。由表1可知，MDA氧化后SP的a*值、b*值、C*值显著降低，L*值、H*值显著升高（P0.05）。在低浓度MDA氧化下，L*值比较稳定24；当MDA浓度高于5 mmol/L时，由于蛋白质聚集体的大量形成引起反射率改变，导致L*值显著升高（P0.05）25-26。a*值的降低被广泛认为是Mb自氧化导致MMb累积的结果，而脂质氧化产生的MDA可以与Mb加成，促进肌红蛋白氧化，导致MMb累积5,10,23。经MDA氧化后SP的b*值下降，刘文轩等17表示可能是MMb的累积导致。C*值和H*值是反映肉色稳定性的重要指标，C*值越大、H*值越小，肉色越鲜红17,27。随着MDA浓度的增加，C*值逐渐减小、H*逐渐增大（P0.05），说明MDA氧化使SP发生褐变，与图1中SP的色泽变化吻合。研究表明，脂质氧化主要通过介导Mb氧化对色泽产生影响8。MDA作为脂质氧化的代表性活性醛，其浓度越大，脂质氧化程度越深，色泽稳定性越低。表 1 MDA氧化对牦牛肉SP的L*、a*、b*、C*、H*值的影响Table 1 Effect of MDA oxidation on the L*,a*,b*,C*and H*values of yak meat SPMDA浓度/（mmol/L）L*a*b*C*H*08.360.45B6.730.24A4.900.09A8.320.25A36.060.50C0.18.680.25B6.430.16A4.860.02AB8.060.12AB37.110.74BC19.100.94B6.230.46AB4.730.26AB7.830.52ABC37.230.56BC29.000.49B5.680.43BC4.590.51AB7.310.66BC38.901.06B58.940.37B5.350.31C4.690.09AB7.120.42CD41.302.15A1010.140.64A4.760.21D4.330.29B6.440.34D42.270.86A注：同列大写字母不同表示差异显著（P0.05）。下同。0 mmol/L0.1 mmol/L1 mmol/L2 mmol/L5 mmol/L10 mmol/L图 1 MDA氧化对牦牛肉SP色泽的影响Fig.1 Effect of MDA oxidation on the color of yak meat SP2.1.2 MDA氧化对牦牛肉Mb氧化状态的影响肉色的呈现主要取决于Mb氧化还原状态26。如图2所示，随着MDA浓度增大，SP中DMb、OMb含量逐渐减少，MMb含量、Mb（IV）O浓度逐渐增多（P0.05），肉色逐渐劣变。大量研究证实了脂质氧化与Mb的氧化存在紧密关联4,10,12,23,28。脂质氧化产生的活性醛MDA，容易扩散至SP中，与Mb发生共价加成，从而加速Mb的氧化2,8。DMb与OMb经MDA氧化后形成MMb，当MDA浓度为2 mmol/L时，MMb含量达59.295%。一般认为，MMb的生成使肉类褪色，当MMb含量达50%时，肉呈现黄褐色，失去销售价值13。此外，在DMb和OMb氧化过程中会产生超氧阴离子自由基（O2）、中性超氧自由基（O2），相互反应形成H2O2等活性物质，这些活性物质与MMb反应进一步生成高价肌红蛋白，如四价铁的超铁肌红蛋白自由基、Mb（IV）O等3,6,10。高价肌红蛋白被认为是肉中脂质和蛋白质氧化的强促氧化剂10。Wang Zhaoming等10研究结果亦表明MDA不仅促进了兔肉中Mb自氧化，还能诱导高价的 Mb（IV）O的形成，从而促进形成氧化环境，转而再加重Mb的氧化应激。说明MDA氧化不仅促进了Mb自氧化，还可能通过氧化应激导致Mb（IV）O形成，不仅导致了色泽稳定性的降低，还促进了肉中脂质和蛋白质的氧化。00.00.11.02.05.010.0010203040804020100FDE60?/%Mb?IV?O?/?mol/L?CBAMDA?/?mmol/L?DMbOMbMMbMb?IV?OFAAEBBDCCCDDBDEEAEF大写字母不同表示组间差异显著（P0.05）。下同。图 2 MDA氧化对牦牛肉SP中Mb氧化状态的影响Fig.2 Effect of MDA oxidation on the oxidation state of Mb in yak meat SP食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.16 1172.2 MDA对牦牛肉SP理化特性的影响2.2.1 MDA氧化对牦牛肉SP羰基含量的影响在剧烈的MDA氧化介导下，DNPH法测定的羰基含量反映了脂质氧化产物对蛋白质造成的氧化损伤程度29。如图3所示，当MDA浓度高于0.1 mmol/L，随 着 M D A 浓 度 增 加，S P 羰 基 含 量 随 之 显 著 增 加（P0.05）。蛋白质羰基化主要有4 种途径，其中脂质氧化产生的MDA可以通过Michael加成将羰基引入蛋白质，引起羰基含量的增加30。Estvez等29研究结果也表明，MDA与蛋白质可以发生亲核反应生成Schiff碱，促进蛋白质羰基化。说明脂质氧化促使了SP的氧化损伤。00.00.11.02.05.010.005010015020040201050ABA30?/?nmol/mg?/?nmol/mg?CDEMDA?/?mmol/L?EEDCBA图 3 MDA氧化对牦牛肉SP羰基含量和总巯基含量的影响Fig.3 Effect of MDA oxidation on the carbonyl and total sulfhydryl contents of yak meat SP2.2.2 MDA氧化对牦牛肉SP总巯基含量的影响SP中的多种酶类物质大多具有半胱氨酸残基，是巯基的主要来源6。如图3所示，MDA浓度超过0.1 mmol/L 后，SP总巯基含量随着MDA浓度增大而逐渐减少（P0.05），说明SP的氧化程度随脂质氧化程度增加而加剧。研究表明，MDA可以与半胱氨酸等氨基酸侧链基团反应，导致巯基含量下降31。经MDA氧化后蛋白质巯基遭受不可逆损伤可能形成二硫键，使SP巯基损失，并促进蛋白质聚合32。2.2.3 MDA氧化对牦牛肉SP二聚酪氨酸含量的影响酪氨酸受到自由基、H2O2等活性物质攻击形成二聚酪氨酸，导致广泛的蛋白质间和蛋白质内交联，在一定程度上反映了蛋白质的氧化程度7。如图4所示，经MDA氧化后，SP的二聚酪氨酸含量显著增加（P0.05）。袁海娜等33研究MDA氧化乳清蛋白时观察到二聚酪氨酸含量的降低，并认为MDA的直接引入未产生自由基，酪氨酸单体之间无法交联形成二聚酪氨酸。而牦牛肉中肌红蛋白含量较高，同时MDA促进了SP中Mb自氧化，生成H2O2等活性物质，从而促进了二聚酪氨酸的生成，使SP氧化程度加重3,8,10。0350400EDCBAF250300200150100?MDA?/?mmol/L?0.00.11.02.05.010.0图 4 MDA氧化对牦牛肉SP二聚酪氨酸含量的影响Fig.4 Effect of MDA oxidation on the dimeric tyrosine content of yak meat SP2.2.4 MDA氧化对牦牛肉SP-MDA加合物荧光强度的影响蛋白质与MDA的相互作用会产生潜在的各种有毒加合物并导致蛋白质的交联31。如图5所示，MDA为0 mmol/L时，400500 nm处没有吸收峰出现；随MDA浓度增加，在463 nm左右出现吸收峰，且荧光强度随之增强，说明SP-MDA加合物的形成和累积。MDA可以与蛋白质和氨基酸残基之间形成Schiff碱或Micheal加合物，其中N-(2-丙烯醛)赖氨酸是MDA与蛋白质共价结合的主要形式2,10。Estvez等29-30也表示MDA及其降解产物与赖氨酸等碱性氨基酸之间可反应形成稳定的加合物，如1-氨基-3-亚氨基丙烯型丙二醛-赖氨酸加合物、1,4-二氢吡啶-3,5-二甲醛、3,5-二甲酰基-1,4-二氢吡啶-4-基吡啶等。此外，SP-MDA加合物的出现也证实了SP羰基化的形成10。43044045046047048049050001503004506007509001 0501 200?/nm0.0 mmol/L0.1 mmol/L1.0 mmol/L2.0 mmol/L5.0 mmol/L10.0 mmol/L图 5 MDA氧化对牦牛肉SP-MDA加合物含量的影响Fig.5 Effect of MDA oxidation on the content of yak meat SP-MDA adducts 2.2.5 MDA氧化对牦牛肉SP表面疏水性的影响表面疏水性可以反映蛋白质分子表面的疏水性氨基酸残基的分布情况，与蛋白质分子之间的疏水相互作用密切相关6。如图6所示，随MDA浓度增加，SP表面疏水性显著下降（P0.05）。据报道34，MDA可以氧化大豆蛋白表面的氨基酸残基，使一些氨基酸残基的疏水侧链转变为亲水基团，形成可溶性聚集物，然后MDA与蛋白质内部氨基酸残基反应，导致蛋白质部分解折叠和疏水性基团的暴露，最后蛋白质交联导致可溶性聚集体进一步聚集，最终形成不溶性聚集体，使表面疏水性降低。此外，剧烈的蛋白质羰基化和疏水基团之间共价交联等118 2023,Vol.44,No.16 食品科学 食品化学也会引起蛋白质的聚集7,35。因此，可能是MDA氧化导致了SP聚集，引起表面疏水性的降低。06987ABCDEA45321?/gMDA?/?mmol/L?0.00.11.02.05.010.0图 6 MDA氧化对牦牛肉SP表面疏水性的影响Fig.6 Effect of MDA oxidation on surface hydrophobicity of yak meat SP2.2.6 MDA氧化对牦牛肉SP内源荧光强度的影响在荧光激发波长为295 nm时，蛋白质的内源荧光主要来自色氨酸，色氨酸残基对微环境变化敏感，因此通过荧光强度的变化可以获取蛋白质的结构和功能信息36。由图7可知，当MDA为0.1 mmol/L时SP内源荧光光谱与0 mmol/L时重合，无明显变化；当MDA浓度逐渐增大，荧光强度逐渐下降，SP三级构象发生变化6。Traverso等9指出MDA氧化诱导羊血清蛋白交联聚集，导致色氨酸被包埋，荧光强度下降。孙领鸽等37亦在MDA氧化核桃分离蛋白中得出相似结论。因此，可能是MDA与SP反应引起蛋白质聚集，使SP内源荧光强度降低。?/nm0.0 mmol/L0.1 mmol/L1.0 mmol/L2.0 mmol/L5.0 mmol/L10.0 mmol/L31032033034035036037038001 0002 0003 0004 0005 0006 000图 7 MDA氧化对牦牛肉SP内源荧光强度的影响Fig.7 Effect of MDA oxidation on intrinsic fluorescence intensity of yak meat SP2.2.7 MDA氧化对牦牛肉SP二级结构的影响FTIR是测定蛋白质二级结构的有效工具38。如图8所示，SP在酰胺A带、酰胺I带、酰胺II带以及酰胺III带等附近出现明显吸收峰。经MDA氧化后SP图谱出现红移或蓝移，其中酰胺II带最大吸收峰蓝移超过10 cm1。据报道，酰胺II带中包含无规卷曲和聚集的-折叠等信息，反映了蛋白质二级结构成分的差异39。因此，MDA可能引起了SP的结构变化。通过进一步分析对蛋白质结构变化敏感的酰胺I带和酰胺III带，确认MDA氧化后SP二级结构的变化情 况38。分别对SP谱图中酰胺I带（1 7001 600 cm1）、酰胺III带（1 3301 220 cm1）进行基线校正、去卷积、二阶求导和Guass拟合，计算得-螺旋（1 6601 651、1 3301 296 cm1）、-折叠（1 6401 600、1 2501 220 cm1）、-转角（1 7001 661、1 2951 271 cm1）和无规卷曲（1 6501 641、1 2701 251cm1）的相对含量40。如图9所示，经一定程度的MDA氧化后，SP的-螺旋、无规卷曲相对含量显著减少，-折叠、-转角相对含量显著增多（P0.05）。李睿41在MDA氧化猪肉源SP中得到相似结果。据报道，无序肽链可以重新排列形成大量分子内或分子间-折叠结构，导致蛋白质聚集42-43，从而引起无规卷曲的减少与-折叠的增多。此外，在蛋白质-蛋白质交联形成过程中，MDA可以与肽键形成氢键，或者与自由氨基反应减少氢键的数量，破坏了蛋白质二级结构的稳定性34。因此，MDA氧化可能促使蛋白质-螺旋向-折叠、-转角无序转化，导致肽链重排，引起蛋白质聚集，破坏结构稳定性。4 000 3 500 3 000 2 500 2 000 1 500 1 0005001 5351 6373 2831 5341 6373 2831 5361 6353 2811 5351 6373 2811 5331 6373 2841 5211 6383 288?/cm?10.0 mmol/L0.1 mmol/L1.0 mmol/L2.0 mmol/L5.0 mmol/L10.0 mmol/L图 8 牦牛肉SP的FTIR图谱Fig.8 FTIR profile of yak meat SPAABABABCBCCCCBCABAACCBCBCABAAAABBB0.00.11.02.05.010.0020406080100?/%-?-?-?MDA?/?mmol/L?图 9 MDA氧化牦牛肉SP二级结构的影响Fig.9 Effect of MDA oxidation on the secondary structure of yak meat SP2.2.8 MDA氧化对牦牛肉SP蛋白质交联的影响SP主要包括一些代谢酶类、伴侣蛋白和肌红蛋白 等14,19。如图10所示，随着MDA浓度增加，小分子条带逐渐模糊弱化直至消失，在顶部逐渐有新的高分子条带产生。研究表明，当蛋白羰基化严重时小分子蛋白会逐渐形成大聚集体，从而引起高分子化合物的生成35。说明MDA氧化逐渐促进了SP的氧化聚集6。MDA作为交联剂，可以通过Michael加成反应促进蛋白质交联10,29。同食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.16 119时，巯基的损失、二聚酪氨酸的生成和加合物的形成均表现了MDA对SP交联聚集的促进作用。MDA?/?mmol/L?245 kDa180 kDa135 kDa100 kDa75 kDa63 kDa48 kDa35 kDa25 kDa20 kDa17 kDa11 kDa?Marker 0.01.02.05.0 10.00.1图 10 MDA氧化牦牛肉SP的SDS-PAGE图谱Fig.10 SDS-PAGE profile of MDA oxidation in yak meat SP2.3 相关性分析在加工与贮藏过程中，MDA与食品蛋白质的相互作用引起蛋白质褐变、蛋白质变性、蛋白质交联聚集等，导致蛋白质理化性质变化和营养特性的下降31。如图11所示，Pearson相关性结果表明MDA浓度与肉色稳定性指标、SP理化性质指标均呈现显著相关性（P0.05）。MDA浓度与a*值、b*值、C*值、DMb含量和OMb含量呈显著负相关，与H*值、MMb含量和Mb（IV）O浓度呈显著正相关（P0.05），说明MDA氧化降低了色泽稳定性。MDA浓度与羰基、二聚酪氨酸、-折叠、-转角含量呈显著正相关，与总巯基含量、表面疏水性、-螺旋和无规卷曲含量呈显著负相关（P0.05），说明MD