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病原物的分离与培养
病原物的分离与培养
一、实验目的
1．学会制作普通的培养基。
2．掌握病原物分离、培养和纯化的一般方法。
二、讲解要点
柯赫氏法则（Koch's Postulate）是通过一系列步骤确定引起病害的病原物的原则和方法，是诊断病害中的证病律。其基本步骤如下：
1．在染病组织上用显微镜经常检查到某种微生物；
2．从病组织中分离得到该微生物，并获得纯培养；
3．将纯培养的微生物接种到健康的感病寄主植物后，发生原先观察到的症状；
4．从接种发病的组织中，再分离，又得到相同的微生物。全过程拟分两次实验完成，本次完成第一和第二步。包括培养基的制作和病原物的分离、培养及纯化。
（一）培养基的制作
真菌和细菌等微生物与其他生物一样，生长和发育都需要一定的营养条件。不同类群的微生物对营养条件的要求不同。因此，在人工培养微生物时，就必须考虑它们的营养要求。培养基就是按照微生物生长，繁殖所需的各种营养物质，用人工的方法配制的基质。
1．常用培养基的配制
植物病理实验室所用的培养基与一般微生物培养基大致相同，只是植物质培养基用得多些。
（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基
这是使用最频繁的培养基，简称PDA，主要用于真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌的培养。配方为：
马铃薯 200g 葡萄糖（蔗糖） 10～20g 琼脂 17～20g 水 1000mL
配制方法：将新鲜的马铃薯洗净、去皮，（注意：发霉、变绿的不要使用。）切成薄片或蚕豆大小的方块，称取所需的重量，倒入锅内，加水1000mL煮沸半小时左右，至马铃薯酥而不烂为止，用四层纱布过滤，然后将事先称好的琼脂加到上述滤液中，用小火加热，使之慢慢融化，并用玻棒不断搅拌，以免烧焦锅底。再加入事先用温水溶化的糖溶液，用二层纱布过滤。测定pH值，用1mol/L的NaOH或HCl调至pH为5.5～6.5之间，最后加水补足至1000mL。
实验中使用的水，一般情况下并不要求用蒸馏水，只要水比较洁净，没有有害物质就可以了，硬水（井水）含有较多的钙镁离子，配制的培养基沉淀较多，最好避免使用。
（2）肉汁胨培养基
肉汁胨培养基主要用于细菌的分离和培养。可以配成培养液体或琼脂培养基使用，配方为：
牛肉浸膏 3g 蛋白胨 5～10g 水 1000mL
将称好的牛肉浸膏和蛋白胨溶于水中，酸度调至pH7，分装灭菌。
每1000mL肉汁胨培养液中加琼脂17～20g，加热，充分搅匀，冷却即配成固体培养基。
（3）植物组织和煎汁
许多植物材料如豆荚、茎秆、种子等，可以放在试管中，加少量水份以保持湿润，灭菌后即能做培养基使用。植物煎汁是很好的培养基，可以满足普通微生物的营养需要，各种植物的煎汁都可用作培养液，如加琼脂即能制成固体培养基。当然，必须灭菌后才能使用。
马铃薯斜面的制作：用木塞穿孔器切取直径比试管直径略小的柱状薯块，将马铃薯块切成斜面。试管底加小块脱脂棉和水1mL，然后放入马铃薯斜面，加上棉塞后灭菌。有些真菌（如镰刀霉属）能在上面产生孢子，有些不容易在琼脂培养基上生长的植物病原细菌，在马铃薯斜面上生长良好。
（4）玉米粉琼脂培养基
这种培养基的养分较少，一般真菌在这种培养基上生长较差，但适用于菌种保存，有些真菌能在这种培养基上产生孢子和子实体。配方如下：
玉米粉 200g， 琼脂 17g， 水 1000mL
量取500mL水，加热至70℃，加入玉米粉，保持温度在60℃左右约1小时，用纱布过滤后，加入适量的水补足500mL。另取500mL水，加入琼脂，加热使之慢慢融化，过滤后补足水至500mL。两液混合后分装，灭菌备用。
2．培养基的分装
根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管或锥形瓶中。
试官分装时，取玻璃漏斗一个，装在铁架上，玻璃漏斗下连接一根乳胶管，乳胶管的另一端连接一细玻璃管，乳胶管上加一止水夹，操作时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管插入试管内，以右手拇指与食指开放止水夹，中指和无名指夹住玻璃管，使培养液直接流入试管内。装入量视试管大小及用途而定，固体培养基的分装量为管高的1/5左右，用锥形瓶分装培养基时，容量不宜超过容积的一半。注意：不要将培养基沾到管口或瓶口上，以免沾湿棉塞而引起污染。
3．灭菌及斜面、平板培养基的制作
将加好棉塞的试管4～5支捆扎好，用牛皮纸（或两层报纸）包住管（瓶）口，然后灭菌，做平板培养基要用的培养皿等，要事先洗净、烘干、包装好，进行干热灭菌。
试管培养基灭菌后，要趁热斜放。先在桌上放一长木板条，然后逐个摆放，使培养基斜面长度为试管长度的2/5至3/5，冷凝后即成斜面培养基。三角瓶中的培养基可趁热倒入已灭菌的培养皿中，制作平板培养基。方法是：将培养基冷却至45～50℃（低于45℃易凝固，应在水浴锅中加热融化），左手拿培养皿，右手拿三角瓶底部，用左手小指和手掌将三角瓶口的棉塞拔下，并握在手中，灼烧瓶口片刻，在酒精火焰旁将培养皿打开一小缝，使瓶口正好伸入，倾入培养基约15mL，平置、凝固即成。注意：操作者事先必须洗净手，并用70%酒精消毒。
（二）真菌的分离
1．分离前的准备工作
分离和培养应在很清洁，甚至无菌的条件下进行。如在无菌室、无菌操作箱、超净工作台和清洁的室内。无菌操作箱的内壁可以用升汞液（1：1000）擦洗，使用超净工作台应事先开动运行15分钟左右。在屋顶四壁清洁而空气较静止的房间进行时，要将地面扫净擦湿，用1：1000的升汞液或清水擦净工作台，并在台上铺一块干净湿白布，将所需物品都放在台布上，工作时避免走动，以减少污染。
2．分离材料的选择
选择新近发病的植株、器官或组织作为分离材料，可以减少腐生菌的污染。从病健交界处分离这一原则对于大部分病害的分离都是适用的。而有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌局限在斑点中央的坏死组织中，从斑点边缘是分离不到病菌的。
3．组织表面消毒
从植株或组织上取下的分离材料，常必须进行表面消毒，以杀死或减少病组织表面的腐生菌，保留组织内部的病原菌。常用的表面消毒液有：
（1）升汞消毒液
配方为：升汞 1g， 浓盐酸 2.5mL， 水 1000mL。
将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后，用水稀释。升汞剧毒、无色，为便于认识，可在溶液中加几滴红染料。消毒时间因材料质地、发病部位深浅及污染情况而异，一般3～5分钟。消毒后用无菌水冲洗3～4次。
（2）漂白粉消毒液
有些真菌对汞、铜等金属离子敏感，可用漂白粉消毒液。其配方为：
漂白粉 10g， 水 140mL。
选用新鲜漂白粉，将漂白粉溶于水中，过滤后使用，随用随配，不能久留，否则因挥发而失去杀菌能力。一般处理3～5分钟，消毒时间亦因材料而异，处理种子用5～10分钟。消毒后用无菌水冲洗，有时也可不必冲洗。
（3）酒精和其它消毒剂
70%酒精也是常用的表面消毒液。将材料在酒精溶液中浸数秒钟到一分钟，然后水洗。有些幼嫩组织只需用脱脂棉蘸酒精溶液少许，擦涂表面，待酒精挥发后，即可放在培养基上培养。
对于特别幼嫩的病组织，因对药物敏感，可以用灭菌水洗8～9次。
4．分离方法
常用的分离方法分为两大类：
（1）组织分离法：分离一小块染病组织，经表面消毒后，移植于平板培养基上培养。很多材料适用此法，下面介绍几种：
斑点病病原菌的分离：挑取新鲜典型的病斑，在病健交界处，剪取5mm2的染病组织，在70%酒精中浸数秒钟，然后移入0.1%的升汞溶液中处理3～5分钟，用无菌水冲洗3次，移入平板培养基上培养。
维管束病菌的分离：先用70%的酒精将根茎表面擦拭消毒，然后用灭过菌的解剖刀剥去表皮，再切取其中一小块变色的部分，用升汞液或漂白粉液消毒，用无菌水冲洗几次后，移到培养基上培养。
种子内病原菌的分离：用升汞溶液或漂白粉溶液进行种子表面消毒，然后用无菌水冲洗，再移于平板培养基上。
（2）稀释分离法
用无菌水从发病组织表面冲下孢子，配成孢子悬浮液，用无菌移液管或滴管吸取一定体积的菌液至平板培养基上，然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻的均匀涂布在整个平板上，或将菌液移至无菌培养皿中，然后倾入融化后冷却至45℃的培养基，轻轻振荡、平置、凝固后倒置培养。并在皿盖上写上日期、分离物名称、分离者姓名。分离工作有时并不顺利，要从分离材料、培养基、培养条件及操作处理方法等方面找原因，改变工作方法，不断进行试验
（三）菌种的纯化
按照上述步骤分离病原物，如果材料很新鲜，本身很少污染，有可能一次分离出纯培养菌。然而多数情况下会发现同一培养皿中有不同的菌落，要做菌种的纯化。纯化的方法很多，下面介绍三种方法。
1．琼脂平板稀释纯化法
将菌种上产生的孢子用无菌水冲洗下，在无菌培养皿中适当稀释后（大致每个培养皿中只有30个左右的孢子），取一定量的孢子悬浮液与融化后冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，制成平板培养基，在适宜温度下培养。然后，从形成的单个菌落边缘上分离菌丝到斜面培养基上培养。
这种方法实质上是分离菌落，主要用于酵母菌和细菌等的纯化，也适用于其它产生孢子较多的真菌的纯化。操作简便，但不能确定一个菌落是否从单个孢子繁殖而来，纯化的可靠性较差。
2．干孢子分离法
干的孢子，如黑粉菌的厚垣孢子和有些担子菌的担孢子等，可用细的缝衣针或解剖针挑取。先将干孢子放在灭菌的玻片上，用食指和大拇指握住缝衣针，在低倍镜下检查，当针尖接触孢子时，孢子即离开玻片附在针尖上，然后移到适宜的培养基上培养。不过，初学者较难成功地利用此法。
3．菌丝尖端分离法
此法适用于不产生孢子或产生孢子而孢子不容易分离的真菌。将真菌培养在培养基表面，用低倍镜找到单独的菌丝尖端后，用内径0.5mm左右的毛细管从菌丝尖端徐徐插入，连同培养基将菌丝尖端切下，然后将这一带有培养基的菌丝移到新的培养基上培养。
（四）真菌的培养
无论是从病部移到培养基上的病原菌，还是准备用于回接到寄主上的病原菌，都要在一定条件下培养。根据试验的要求，可将纯化的菌种，移植到适当的固体或液体培养基上培养，也可以用锥形瓶盛麦粒、玉米粉、麦秆、锯末、麸皮等培养基质，进行大量繁殖。
一般真菌只要满足20～30℃的温度即可生长，少数真菌由于研究其生理的特殊需要，应在一定的恒温条件下培养。
培养过程中要注意检查和记载，一般真菌经24小时培养后即可检查其生长情况，如：有无污染、温度是否合适等。真菌的培养性状最好是培养在琼脂平板培养基上观察和描述，观察和记载的项目主要有：
1．菌落的质地；
2．菌落是凸起的还是成簇的菌丝体；
3．形成成堆的孢子是干性的还是粘性的；
4．各种子实体和休眠结构（厚垣孢子、菌核等）的形成及所需的时间；
5．菌落正面和背面的颜色，有无色素渗入培养基中；
6．有无特殊气味；
7．菌落中有无部分呈扇形；
8．生长率的快慢，如菌落长到一定直径所需的时间。
菌落的颜色也要仔细地不断地观察，它的颜色往往随着培养时间而改变。此外，培养性状的描述，要注明培养基的种类、培养温度和有无光照等。
三、实验材料与用具
无菌室或接种箱，手提式高压蒸汽灭菌锅、电炉、天平、铁架台、灭菌培养皿、250mL锥形瓶、漏斗、试管、2000mL烧杯、小烧杯、移液管、止水夹、石蕊试纸、乳胶管、报纸、棉花、医用纱布、解剖剪、接种环、酒精灯；
马铃薯、琼脂、葡萄糖（或蔗糖）、NaOH溶液、盐酸、漂白粉、70%酒精、升汞；
叶斑病病叶、甘薯黑疤病、萝卜软腐病。
四、实验步骤
（一）叶斑病类的分离法
1．准备工作
（1）PDA培养基的制作及无菌水的准备
按照前面介绍的方法，配制好PDA培养基，分装入试管和锥形瓶中，包装好，在250mL的锥形瓶中装入100mL左右自来水，塞上棉塞，包装好，连同培养基一起灭菌，灭菌完毕，制作斜面培养基和平板培养基。制好的培养基最好保温培养2～3天，检查灭菌效果后使用。
（2）分离室的清洁
用5%石炭酸或1：40福尔马林溶液在分离室或接种箱中消毒，或用紫外线照射10～20分钟。
（3）穿好工作服。
（4）用肥皂洗净手。
2．分离工作
一切准备工作就绪后，进入分离室或坐在分离箱旁。
（1）点燃酒精灯，用少许脱脂棉蘸70%酒精擦手。
（2）取装有培养基的培养皿二套，在皿盖上注明分离材料、日期及分离者姓名。
（3）从病叶上选择典型的单独病斑，在病健交界处剪取约4mm2的病组织10块，放入小烧杯中。
（4）用70%的酒精或0.1%升汞对病组织块进行表面消毒。
（5）用无菌镊子将消毒过的组织块移到平板培养基上，每皿4～5块。
（6）将培养皿倒置于26～28℃的恒温箱中培养。
（7）数日后病组织周围长出菌丝体而形成菌落，经鉴定（镜检）无误后，可留作纯菌种。
（8）用火焰灭菌接种针，在菌落边缘取一小块带病菌的培养基，移到试管斜面上培养，得到纯菌种。
（二）果实、块茎、茎秆或维管束内部病菌的分离法
1．准备工作：同叶斑病类分离法。
2．分离工作
（1）点燃酒精灯，用70%的酒精擦手。
（2）取平板培养基两培养皿，在皿盖上注明分离材料、分离者姓名等。
（3）取有黑疤病的甘薯，用脱脂棉蘸70%的酒精少许，涂拭薯块病部表面及周围，通过火焰烧去遗留的酒精，重复进行2～3次。
（4）用解剖刀经火焰灭菌后，将病部表皮削去，在病健交界处取小块变色的组织，直接移到平板培养基上，每皿3～4块。
（5）将培养皿倒置于26～28℃恒温箱中培养。
（6）以下步骤同叶斑病类分离法。
五、作业
1．每人交纯菌种试管一支。
2．书面报告分离结果，有无污染发生，分析原因。
实验九 柯赫氏法则（二）--接种诱发和病原物致病性的证实
一、实验目的
1．深对病原物传染、侵染等概念的理解；
2．掌握几种常用的接种方法；
3．在上一次试验的基础上，了解柯赫氏法则的全过程。
二、讲解要点
病原菌的种类很多，其传播途径各不相同，主要有种子、土壤、气流和昆虫等。因此，在人工接种时，要采用不同的方法。接种技术广泛地应用于寄主范围和品种抗病性测定、病菌致病性变异、病害流行及防治等项研究。下面介绍几种常用的接种方法。
（一）种子传染病害的接种
1．拌种法 用病菌的孢子拌种是黑粉菌常用的接种方法。
2．浸种法 孢子悬浮液浸种也是常用的方法。浸种时抽气减压，可以使孢子渗入种子内部，从而提高接种效率。在人工培养基上不易产生孢子的病原菌，可以用搅碎的菌丝悬浮液浸种。
（二）土壤传染病害的接种
1．土壤接种法 是将病菌在播种前或播种时半在土壤中的接种办法。如立枯病即可将人工培养的菌丝拌入灭菌的土中，然后播种。在所有病害的接种实验中，以土壤接种最为复杂。主要原因是病菌易受土壤物理、化学及生物学性质的影响。
2．蘸根接种法 是将幼苗的根部稍加损伤，然后将受伤的根部蘸上孢子或菌丝悬浮液的接种方法。这种方法使病菌能与根部直接接触，受土壤微生物的影响较小。同时，根部有损伤，病菌也易侵入，效果比土壤接种法好，常用于枯萎病等的接种。
（三）气流和雨水传播病害的接种
1．喷雾法 将孢子（或菌丝）悬浮液喷洒在寄主表面，病菌可以从气孔、伤口和表皮直接侵入。叶背气孔数目一般比叶正面的多，对于从气孔侵入的病菌，则应注意喷洒叶背；对于从伤口侵入的病菌，喷洒前应用细砂土或金刚砂摩擦叶面，使叶表稍损伤；叶面有蜡质的，接种时可用湿布将蜡质层擦去。
2．喷粉法 是将一定量的干孢子与滑石粉混匀后，放在小喷粉器中喷洒在潮湿的植物表面的接种法。滑石粉的量一般是孢子量的10倍左右。如白粉菌和锈菌等的接种。
3．涂抹法 涂抹法是先用手指蘸水摩擦叶片，去掉蜡质层，使表面有一薄层水膜，然后将孢子涂抹在上面的接种法。
喷雾、喷粉和涂抹接种后的植物，必须保湿约24小时左右，使病菌孢子能萌发侵入。
4．注射法 是将病菌孢子悬浮液用注射器注入寄主生长点或幼嫩部分的接种法。
5．针刺法 是指用灭菌的针刺伤寄主植物组织，然后将病菌接种在伤口内或用灭菌的针蘸菌脓刺伤寄主组织的接种法。此法用于伤口侵入的病菌。如块茎、果实、块根等的腐烂病菌。
（四）昆虫传播病害的接种：昆虫主要作为病毒病的传播媒介，接种方法详见实验七。
三、实验材料及用具
玉米小斑病菌、甘薯黑疤病病菌；玉米苗、新鲜无病甘薯；
恒温恒湿箱、小喷雾器、显微镜、接种针、接种环、酒精灯、70%酒精等。
四、实验步骤
（一）玉米小斑病的接种--喷雾法
1．取玉米小斑病病菌的纯培养，用无菌水配成孢子悬浮液，使悬浮液中的孢子在显微镜的低倍视野中有10个左右。然后，将此悬浮液装入小喷雾器中。
2．取培育的玉米苗两株（无病），一株喷孢子悬浮液，注意叶片两面都要喷湿，另一株喷洒请水，作为对照。
3．将上述玉米苗放在同样的恒温恒湿箱中培养，24小时后取出，置于温室内，进行正常管理。逐日观察症状，记载发病情况。
（二）甘薯黑疤病的接种--针刺法
取新鲜无病的甘薯一个，洗净，用脱脂棉蘸70%的酒精少许，在接种部位涂拭消毒，晾干后，用灭菌的解剖针刺伤，用灭菌的接种环挑取少许甘薯黑疤病菌的纯培养，接种在刺伤的部位。另选一处刺伤后不接种病菌，作为对照。每个甘薯可做3～5个重复。然后，将甘薯放在保湿器中，放入25℃的恒温箱中。逐日观察症状，记载发病情况。