白芍多糖与白芍总苷不同配比对小鼠亚急性酒精肝损伤的研究.pdf

22中国处方药 第 21 卷 第 9 期实验研究酒精性肝病（ALD）是由于长期大量饮酒而导致的肝脏慢性中毒，继而引起肝脏损伤，一般临床表现为脂肪肝、肝炎、肝硬化三种类型，严重可致肝功能衰竭，ALD 的发病率逐年升高成为了不容忽视的、严重威胁大众健康的隐形杀手1。白芍是毛莨科植物芍药 Paeonia lactiflora Pall的干燥根，具有养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳的作用2。白芍在传统中医学理论中具有良好的保肝作白芍多糖与白芍总苷不同配比对小鼠亚急性酒精肝损伤的研究曾琬婷，才谦（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600）【摘要】目的 研究白芍多糖与白芍总苷不同配比对小鼠亚急性酒精肝损伤的影响。方法 取健康的昆明种小鼠 140 只，18 22 g，分成 14 组，空白组、模型组、阳性药组、白芍多糖与总苷配比组（010，19，28，37，46，55，64，73，82，91，100），每组 10 只小鼠，分别以一定量进行灌胃，阳性药组以水飞蓟素片 200 mg/kg 灌胃。模型组、阳性药组和给药组于实验结束前 14 d 每天灌胃给予 30%的乙醇。腹主动脉采血，并取肝组织，测定血清中胆固醇（TC）、总胆红素（TBil）、低密度脂蛋白（LDL）含量及病理组织学检查。结果 白芍多糖与白芍总苷不同配比组均能降低血清中 TC、TBil、LDL 含量，病理学结果显示各配比组炎性浸润有不同程度减小，脂肪变性程度减轻，其中 010 组效果最好。结论 白芍多糖与白芍总苷不同配比均能降低小鼠亚急性酒精肝损伤，且 010组效果最好。【关键词】白芍多糖；白芍总苷；不同比例配伍；亚急性酒精肝损伤Study on subacute alcohol induced liver injury in mice with different ratios of Paeonia lactiflora polysaccharide and total glucosides of Paeonia lactiflora ZENG Wan-ting，CAI Qian.College of Pharmacy Liaoning University of traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China.【Abstract】Objective To study the effects of different compatibility of Paeonia lactiflora polysaccharide and total glucosides of Paeonia lactiflora on subacute alcohol liver injury in mice.Methods 140 healthy Kunming mice，18 22 g，were divided into 14 groups：blank group，model group，positive drug group，compatibility group of Paeonia lactiflora polysaccharide and total glycosides（010，19，28，37，46，55，64，73，82，91，100）.10 mice in each group were gavaged with a certain amount.The positive drug group was gavaged with silymarin tablets 200 mg/kg.The model group，positive drug group and the administration group were given 30%ethanol by gavage 14 days before the end of the experiment.Blood was collected from abdominal aorta and liver tissue was taken.The contents of cholesterol（TC），total bilirubin（TBil），low density lipoprotein（LDL）in serum and histopathological examination were measured.Results Different compatibility groups of Paeonia lactiflora polysaccharide and total glucosides of Paeonia lactiflora could reduce the contents of TC，TBil and LDL in serum.The pathological results showed that the inflammatory infiltration and steatosis of each matching group were reduced in varying degrees，and the effect of 010 group was the best.Conclusion Different ratios of Paeonia lactiflora polysaccharide and total glucosides of Paeonia lactiflora can reduce subacute alcohol liver injury in mice，and the effect of 010 group is the best.【Key words】Paeonia lactiflora polysaccharide；Total glucosides of Paeonia lactiflora；Different proportions of matching；Subacute alcoholic liver injury通信作者：才谦，Email：J.天津药学，2004，（3）：10.30 林飞武，王自善，戎珍，等.柴胡的药理作用、化学成分及开发利用研究 J.亚太传统医药，2020，16（10）：202-205.31 黄敬文，高宏伟，段剑飞.地龙的化学成分和药理作用研究进展 J.中医药导报，2018，24（12）：104-107.32 Yeung YT，Aziz F，Guerrero-Castilla A，et al.Signaling Pathways in Inflammation and Anti-inflammatory TherapiesJ.Curr Pharm Des，2018，24（14）：1449-1484.33 Kalliolias GD，Ivashkiv LB.TNF biology，pathogenic mechanisms and emerging therapeutic strategiesJ.Nat Rev Rheumatol，2016，12（1）：49-62.34 Hirano T.IL-6 in inflammation，autoimmunity and cancerJ.Int Immunol，2021，33（3）：127-148.35 Shi D，Jiang P.A Different Facet of p53 Function：Regulation of Immunity and Inflammation During Tumor DevelopmentJ.Front Cell Dev Biol，2021，9：762651.23Journal of China Prescription Drug Vol.21 No.9实验研究用。现代药理研究发现有免疫调节、抗氧化、保肝等药理活性3。白芍中还富含多糖，已有的研究表明多糖这类物质多具有调节免疫和抗氧化的药理作用4，如枸杞多糖对小鼠的酒精性肝损伤有一定保护作用，其作用机制可能与增强体内抗氧化能力有关4。白芍多糖对肝损伤也有保护作用5。本实验将探究白芍中的多糖和总苷进行不同比例的配比后对小鼠亚急性酒精性肝损伤是否有保护作用，并找出治疗效果最好的配比，为白芍的深入开发奠定基础。1 材料1.1 实验动物140 只雄性 SPF 级昆明种小鼠（18 22 g），购于本溪长生生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001。1.2 实验药品及试剂白芍多糖（自制）；白芍总苷（自制）；水飞蓟素片（批号：H20090217，德国马博士大药厂）；乙醇（批号：211103，山东德新康医疗科技有限公司）；胆固醇（TC）试剂盒（批号：2400210，中生北控生物科技股份有限公司）；低密度脂蛋白（LDL）试剂盒（批号：2400174，中生北控生物科技股份有限公司）；总胆红素（TBil）试剂盒（批号：2401311，咸宁吉斯生物科技有限公司）。1.3 主要仪器CS-600B 型全自动生化分析仪（长春迪瑞实业有限公司）；HC-3618R 高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；JA2003B 型千分之一电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；DNM-9602 型酶标仪（北京普朗斯新技术有限公司）；723 可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。2 实验方法2.1 药品制备对白芍总皂苷与粗多糖进行系统分离。采用水提醇沉法6提取白芍中的多糖类物质；采用醇提及大孔吸附树脂法7提取白芍中的总皂苷。2.2 动物分组及造模取健康的昆明种小鼠 140 只，18 22 g，随机分成 14组，空白组、模型组、阳性药组、白芍多糖与总苷不同比例配 伍 组（010，19，28，37，46，55，64，73，82，91，100），每组 10 只小鼠。前 14 d 白芍多糖与总苷不同比例配伍组以不同比例的多糖总苷5 ml/kg灌胃，阳性药组以水飞蓟素片 200 mg/kg 灌胃，其余组灌胃适量生理盐水。从第 15 天至 28 天，模型组、阳性药组和白芍多糖与总苷不同比例配伍组每天经口灌胃给予 30%的乙醇 10 ml/kg。其中白芍多糖与总苷不同比例配伍组 30%乙醇灌胃后间隔 4 h 以上再给予等量 30%的乙醇。2.3 生化指标的检测实验结束前禁食 4 h，经腹腔注射 60 mg/kg 的戊巴比妥钠溶液麻醉后，腹主动脉采血，并取肝组织，进行各项指标的检测及病理组织学检查。血清胆固醇（TC）采用酶法（COD-PAP 法），血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL）采用匀相测定法，血清胆红素（TBil）采用改良 J-G 法。血样离心（2 500 r/min）后取上清液，上全自动生化仪测定血清中TC、LDL 和 TBil 的含量。2.4 肝脏组织检测取小鼠肝脏左叶用 10%福尔马林固定，从肝左叶中部做横切面取材，常规制片，HE 染色。用 5 倍物镜连续观察整张组织切片，主要观察肝细胞变性（脂肪变性、水样变性、胞浆凝聚、气球样变）、肝细胞坏死和炎症改变等，并同时给予记录。2.5 数据处理采用 SPSS 16.0 软件进行统计分析，计量资料以（s）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，以P 0.05 为差异有统计学意义。3 结果与分析3.1 小鼠一般情况小鼠在形成亚急性酒精性肝损伤模型中，表现为毛色无光泽，体重减轻，行为迟缓，灌乙醇溶液后出现昏睡。3.2 血清指标实验结果如表 1 所示，与空白组相比，模型组中总胆红素、胆固醇和低密度脂蛋白含量显著升高（P 0.05），说明造模成功。与模型组相比，各给药组总胆红素、胆固醇和低密度脂蛋白含量均显著降低（P 0.05）。在对总胆红素和胆固醇两个指标的调节方面，白芍多糖总苷 010 组效果最趋近于空白组；对低密度脂蛋白的调节方面，白芍多糖总苷 010 组虽没有 28 组的效果好，但二者结果无显著性差异。综合不同配比组对这三个指标的调节结果，可知白芍多糖总苷 010 组的作用最佳。3.3 肝组织病理切片结果切片结果如图 1 显示，肝小叶结构清晰，肝索排列整齐呈放射状，肝细胞分界清楚、形态规则无肝细胞变性、肝细胞坏死和炎症改变（见图 1-1）；图 1-2 可见肝小叶结构不清，肝窦狭窄，肝细胞弥漫性肿胀，肝细胞呈片状气球样变性，部分细胞出现坏死和炎性浸润；图 1-3 肝组织无明显脂肪变性，肝小叶内未见明显的肝细胞坏死，肝细胞变性程度大幅度减轻；图 1-4 效果较好，肝小叶结构基本保留，肝窦轻度狭窄，肝细胞轻度至中度颗粒变性，偶见肝细胞坏死及炎性浸润；图 1-5 气球样变的肝细胞占整个视野的 1/3 以上，脂肪变性肝细胞占 1/3 以上，部分肝24中国处方药 第 21 卷 第 9 期实验研究细胞坏死；图 1-6 气球样变的肝细胞占整个视野的 1/3 以上，脂肪变性肝细胞占 1/3 以上，胞浆凝聚的肝细胞占整个视野的 1/3 以上，散在分布坏死细胞；图 1-7 偶见肝细胞气球样变，偶见肝细胞胞浆凝聚，少数坏死细胞；图 1-8气球样变的肝细胞占整个视野的 1/3 以内，偶见肝细胞脂肪变性，偶见肝细胞胞浆凝聚，部分炎性浸润；图 1-9 气球样变、脂肪变性、胞浆凝聚、水样变性肝细胞均占整个视野 1/3 以上，部分细胞炎性浸润；图 1-10 气球样变和脂肪变性肝细胞占整个视野 1/3 以上，胞浆凝聚和水样变性肝细胞占 1/3 以内，散在分布坏死细胞；图 1-11 气球样变和水样变性肝细胞占整个视野 1/3 以内，胞浆凝聚和脂肪变性肝细胞占 1/3 以上，少数炎性浸润；图 1-12 气球样变和脂肪变性的肝细胞占整个视野的 1/3 以上，胞浆凝聚和水样变性肝细胞占整个视野的 1/3 以内，少数细胞坏死；图1-13 气球样变、脂肪变性、胞浆凝聚的肝细胞占整个视野的 1/3 以上，水样变性的肝细胞占整个视野的 1/3 以内，多数细胞炎性浸润；图 1-14 气球样变和脂肪变性肝细胞占1/3 以内，胞浆凝聚和水样变性的肝细胞占整个视野的 1/3以上，部分细胞坏死。4 讨论酒精性肝损伤是由于长期饮酒所致，初期一般表现为脂肪肝，进而发展成酒精性肝炎甚至肝功能衰竭，目前该病为我国常见的疾病之一8。在本世纪初期，陕西省酒精性肝病流行病学调查中9显示，普通成年人患病率大概为4.3%6.5%。白芍最早记载于 神农本草经，为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，味苦、酸，性微寒，具有养血调经、柔肝止痛、平抑肝阳的作用10。研究表明白芍总苷是白芍发挥其保肝作用的有效部位，具有抗急性肝损伤、慢性肝纤维化等多种作用11。大量研究发现，免疫功能的异常改变和氧自由基的大量产生是引起肝组织损伤的重要原因，而白芍总苷（TGP）显著的双向免疫调节作用和抗氧化作用可能在肝炎的治疗中发挥重要作用。研究发现3，白芍多糖也有很好的保护肝脏活性。通过本实验造模后，总胆红素、胆固醇和低密度脂蛋白含量显著升高，说明造模成功；肝组织切片病理结果中肝小叶结构不清，肝窦狭窄，肝细胞弥漫性肿胀，肝细胞呈片状气球样变性，部分细胞出现坏死和炎性浸润说明已造成肝损伤病理模型。在血清指标结果中，与模型组相比，各给药组总胆红素、胆固醇和低密度脂蛋白含量显著降低并且数值均趋于空白组。在对总胆红素和胆固醇两个指标的调节方面，白芍多糖总苷 010 组效果最趋近于空白组；对低密度脂蛋白的调节方面，白芍多糖总苷 010 组虽没有白芍多糖总苷 28 组的效果好，但二者结果无显著性差异。综合不同配比组对这三个指标的调节结果，可知白芍多糖总苷 010 组的作用最好。肝组织病理切片结果中空白组肝小叶结构清晰，肝索排列整齐呈放射状，肝细胞分界清楚、形态规则无肝细胞变性、肝细胞坏死和炎症改变；阳性药组肝组织无明显脂肪变性，肝小叶内未见明显的肝细胞坏死，肝细胞变性程度大幅度减轻；各给药组的病理切片结果显示肝细胞的变性、坏死等均有不同程度的好转，其中（多糖总苷）010、46、82、28 组细胞恢复效果均接近于空白组，综合血清指标结果认为 010 组治疗效果更好。本实验通过酒精灌胃的方式造模，符合人类饮酒而导致肝损伤的特点，是实验的关键之一。血清中胆固醇、总胆红素、低密度脂蛋白指标的升高也是肝损伤的一大特征。酒精性肝病的主要表现有乏力、恶心、黄疸等，黄疸患者血液中胆固醇含量升高，因此模型组胆固醇含量偏高；总胆红素是肝功能内一个重要的指标，它的升高提示肝细胞损伤；低密度脂蛋白是富含胆固醇的脂蛋白，是由极低12345671011121314981、空白组；2、模型组；3、阳性药组；4、010（多糖：总苷）组；5、19 组；6、28 组；7、37 组；8、46 组；9、55 组；10、64 组；11、73 组；12、82 组；13、91 组；14、100 组图 1 各组小鼠肝组织病理切片结果（10 倍镜下）表 1 各组小鼠血清中总胆红素、胆固醇、低密度脂蛋白的含量（s，mol/L）组别总胆红素胆固醇低密度脂蛋白空白组8.270.32317.6112.73160.365.42模型组11.560.28a480.4216.42a222.146.79a阳性药组9.730.37b382.1818.21b186.5610.36b（多糖：总苷）0109.770.33b398.8419.04b193.217.02b2810.010.38b401.6616.28b191.457.17b469.870.30b405.7112.86b196.946.20b3710.040.35b401.3521.18b193.468.78b1910.020.34b410.2813.82b192.086.06b559.920.72b412.6341.36b194.6215.08b6410.520.35b425.1918.34b200.177.21b7310.520.36b438.6817.41b203.695.17b8210.730.44b434.7815.41b206.757.34b9110.560.36b441.4212.36b207.628.09b10010.500.33b423.1812.24b201.994.92b注：a与空白组相比，P 0.05；b与模型组相比，P 0.0525Journal of China Prescription Drug Vol.21 No.9实验研究密度脂蛋白转变而来，当肝功能受损时极低密度脂蛋白含量升高，因此低密度脂蛋白也升高。实验中胆固醇、总胆红素、低密度脂蛋白的升高也证明了造模成功。各配比组干预后均能有效降低因酒精升高的的指标水平。病理结果显示各配比组脂滴聚集有不同程度减小，脂肪变性程度减轻。本实验结果表明，白芍多糖白芍总苷 010 配比组效果最好，为新药的研究提供了依据。参考文献1 梁瀚文.酒精性肝病的治疗现状分析 J.现代商贸工业，2019，40（13）：77-79.2 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部 M.北京：中国医药科技出版社，2020：108-1093 秦亚东，钟正灵，汪荣斌，等.白芍多糖对 D-半乳糖胺/脂多糖诱导小鼠急性肝损伤的保护作用 J.中国临床药理学与治疗学，2015，20（8）：854-858.4 陈伟伟，莫来铭，陈放放，等.多糖对酒精诱导小鼠肝损伤保护作用的研究进展 C./中国生物工程学会 2014 年学术年会暨全国生物技术大会论文集.2014：1-8.5 魏芬芬，王文娟，贺青华，等.枸杞多糖对小鼠酒精性肝损伤的保护作用及机制研究 J.药物评价研究，2019，42（5）：852-857.6 王雪锋，龙冬梅，宋洁，等.白芍花多糖提取工艺的研究J.广东化工，2019，46（2）：35-36.7 金英善，陈曼丽，陶俊.芍药化学成分和药理作用研究进展 J.中国药理学与毒理学杂志，2013，27（4）：745-750.8 中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.酒精性肝病诊疗指南 J.中国肝脏病杂志（电子版），2010，2（4）：49-53.9 鲁晓岚，陶明，罗金燕，等.饮酒与肝病流行病学调查 J.中华肝脏病杂志，2002，10（6）：68-69.10 刘萍.芍药、白芍、赤芍的历代本草考证浅析 J.中华中医药杂志，2018，33（12）：5662-5665.11 齐慧慧，宋佳，陈岳祥.小鼠急性酒精性肝损伤模型的建立 J.世界华人消化杂志，2012，20（9）：759-763.当归补血片的成型工艺研究韩建鹏1，孙萍2，周彩娟1，冯东燕1，李萌萌1，刘旭海2（1 江西中医药大学，南昌 330004；2 江中药业股份有限公司，南昌 330049）【摘要】目的 优选当归补血片最佳处方及成型工艺条件。方法 考察不同辅料对浸膏粉吸湿性、成型性的影响，采用混料设计和综合评分法优选当归补血片成型工艺条件，考察不同种类、不同配比条件下辅料对于湿法制粒所得颗粒的吸湿性、流动性、成型性、堆积性、可压性、稳定性影响，再结合最终成片抗张强度、崩解时限等参数，优选出当归补血片的最佳辅料，其中，本研究的关键是采用扭矩流变仪（MTR-3）对不同辅料、不同种类润湿剂条件下对当归补血片湿法制粒的流变分析。结果 最优工艺条件为浸膏-辅料比为42.35%：57.65%；微晶纤维素 101、甘露醇和乳糖以 25.4%11.9%9.35%的配比当作填充剂；10%配比的交联聚维酮（PVPP）作崩解剂；1%配比的硬脂酸镁作润滑剂；15%乙醇作润湿剂，乙醇用量为 0.2 ml/g。结论 该片剂所选辅料合理，成型制备工艺高效可行，本研究表明扭矩流变仪在湿法制粒过程发挥关键作用，精准确定润湿剂的用量和制粒终点，为当归补血片成型工艺条件以及最优处方的确立提供了科学的实验依据。【关键词】当归补血片；扭矩流变仪；混料设计；湿法制粒；综合评价Study on the molding process of Danggui Buxue TabletsHAN Jian-peng，SUN Ping，ZHOU Cai-juan，et al.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China.【Abstract】Objective To select the best prescription and molding process conditions for Danggui Buxue Tablets.Methods The effects of different excipients on the hygroscopicity and formability of the infusion powder were investigated，and the mixing design and comprehensive scoring method were used to optimize the forming process conditions of Danggui Buxue Tablets.To investigate the effects of different excipients on the hygroscopicity and formability of the powdered extracts，and to optimize the forming conditions of Danggui Buxue Tablets by using mixing design and comprehensive scoring method.The key of this study was the rheological analysis of the wet granulation of Danggui Buxue Tablets with different excipients and different types of wetting agents by using torque rheometer（MTR-3）.Results The optimal process conditions were：the ratio of extract to auxiliary material was 42.35%：57.65%；microcrystalline cellulose，mannitol and lactose in the ratio of 25.4%：11.9%：9.35%as filler；10%of cross-linked povidone as disintegrant；1%of magnesium stearate as lubricant；and 15%of ethanol as wetting agent with 0.2 ml/g of ethanol.Conclusion The selected excipients are reasonable and the molding preparation process is efficient and feasible.This study shows