植物细胞工程实验室及基本操作.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,实验室设置及仪器设备,2,实验基本操作,3,培养基的成分及其配制,4,培养条件的选择,植物细胞工程实验室及基本操作,1,1,实验室设置及仪器设备,实验室是进行组培研究的主要场所，应能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌操作、培养、鉴定等多方面的工作。,2,1,基本实验室,1.1,洗涤间,根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在,30-50m,2,。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置,2,个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备,1-2,个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。地面应耐湿并排水良好。,3,4,面积,60,平方米左右，配备的主要仪器设备有：冰箱、天平、微波炉、,pH,计、培养基分装器、药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积,180-200L,为宜，用于储存培养基母液、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保存植物材料。天平应有不同感量。,1.2,培养基配制间,5,6,配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。如果没有条件的话，可以将上述工作间合并成一个准备间，要求是设备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。,1.3,消毒间,7,8,无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种接种器械等。,1.4,无菌操作室,9,10,为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用,40W,，固定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在,20cm,，光照强度为,2000-3000lx,。,1.5,培养室,11,12,13,2,辅助实验室,2.1,鉴定室,细胞学鉴定室,其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等。,生化分析室,在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。离心机、酶联免疫检测仪、天平、,PCR,仪等。,14,15,为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。,2.2,、温室,16,(1),洗涤液的配制,2,实验基本操作,一,.,洗涤技术,17,A,、,新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用,0.5,的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在,1,2,盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在,100,120,烘箱内烘干备用。,(2),洗涤方法,18,先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在,0.5,的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。,B,、使用过的玻璃仪器的清洗,19,聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化学实验中已用的越来越多。第一次使用塑料器皿时，可先用,8mol/L,尿素（用浓盐酸调,pH=1,）清洗，接着依次用无离子水、,1 mol/L KOH,和无离子水清洗，然后用,10,3,mol/L EDTA,除去金属离子的污染，最后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用,0.5,的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净即可。,C,、塑料器皿的清洗,20,金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。,E,、除菌过滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。,D,、金属用品洗涤,21,（一）、灭菌工作是极其重要的。,首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴：有菌：,凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。,无菌,：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）,物理或化学处理；,火烤后的物体；,健康的动植物不与内外部表面接触的组织,内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但,不会影响培养，也不会污染）,二,.,灭菌,22,1,、,物理方法,：干热、湿热、过滤（,0.25,微米）紫外灯、超声波等。,2,、,化学方法,：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等,（二）、灭菌的方法,23,干热灭菌,玻璃器皿、器械,湿热灭菌,培养基、蒸馏水、器械、棉塞等,熏蒸灭菌,接种室、培养室,过滤灭菌,液体培养基、蒸馏水,药剂灭菌,培养材料,烧灼灭菌,器械、瓶口、棉塞、包头纸,辐射灭菌,接种室。培养间,各种灭菌方法及其使用范围,24,适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：,150,、,40min,或,120,、,120min,，如果发现芽孢杆菌，,160,、,90120min,（,1,）干热灭菌,25,适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。,121,维持,2030min,注意点：加足水、排尽气、气压降到,0,时，才能开盖,（,2,）湿热灭菌,26,培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂,GA3,、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径,0.220.45,微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至,50,左右时，加入适量的激素，然后分装。,（,3,）过滤灭菌,27,主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间,2030min,。注意：关灯后,5min,后再进入。超净工作台关灯后要打开风机。,（,4,）射线灭菌,28,用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。,（,5,）火焰灼烧灭菌,29,适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。几种常用消毒剂的效果比较,消 毒 剂,使用浓度,(%),消毒时间,(min.),效 果,残液去除难易,乙醇,70-75,0.1-3,好,易,新洁尔灭,10,20,5,30,好,易,氯化汞,0.1,1,2,15,最好,最难,过氧化氢,10,12,5,15,较好,最易,抗菌素,4,50mgl,-1,30,60,较好,较难,次氯酸钙,/,纳,9,10,5,30,好,易,（,6,）消毒剂,30,长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：,甲醛、高锰酸钾熏蒸,。甲醛的用量通常按每立方米空间,2-6,毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内,(,最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗,),，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。,熏蒸灭菌,31,甲醛熏蒸接种室应至少在使用前,24,小时进行，熏蒸后密闭保持,4,小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前,2,小时进行。对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸,32,人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。,物品因素,器皿和用具,培养皿：洗热压,玻璃器皿：洗干热（干热箱）或晾干,接种用具：用,CCL,4,布擦湿布擦,泡,75%95%,酒精烧,培养基：湿热,培养材料,外部细菌：用水冲洗化学药剂处理,内部细菌,茎尖培养,加抗生素：青霉素、利福平,操作的空气：洗刷地板,95%,酒精擦超净工作台,用化学试剂薰蒸,污染来源,三、无菌操作技术,33,1,、实验器具和材料的准备,2,、用,75%,的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌,20min-30min,。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。,3,、关紫外灯、打开风机，过,5-10min,进入缓冲间，以,75%,洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）,34,4,、用,70,75,的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。,35,5,、取流水冲洗（至少,30min,）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗,34,次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。,36,6,、打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。,7,、用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。,37,注意（,1,）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。（,2,）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。（,3,）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（,4,）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。,38,（,5,）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。（,6,）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。（,7,）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。,39,接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中,正,确,错,误,40,整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速,正,确,错,误,41,接种过程中尽可能达到悬空要求,防止操作带来的污染,正,确,错,误,42,接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口,正,确,错,误,43,瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口,正,确,错,误,44,接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生,45,种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足,正,确,错,误,46,接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中,正,确,错,误,47,用于外植体分离的母体植物材料一般有,3,种来源：一是,生长在自然环境下的植物,；二是,在温室控制环境条件下生长的植物,；三是,无菌环境下已经过离体培养的植物,。,四、外植体的选择与处理技术,48,1,、选择优良的基因型,试验首先要明确目的。例如，蔬菜、作物等的脱毒快繁，是为了脱去病毒，提高产量和质量，就应选择当地栽培确认的高产优质的品种作为脱毒的材料，并且品种一定要可靠。花卉、观赏植物的快繁，也应选择有价值的植物。,2,、取材,从生长旺盛、健壮、无病虫害的植株上取材。母柱代谢旺盛期切取的外植体再生能力强，试验容易成功。,（一）、外植体的选择,49,3,、外植体大小选择,因外植体不同而不同。如利用茎尖培养，茎尖大小对脱毒效果非常明显。再如幼胚培养，胚龄也非常重要。（以后具体讲）,4,、选择外植体的时期,外植体的生长动态往往与该物种的生长规律（生物钟）有关。因此，最好在植物生长的最适宜时期取材培养。会得到较好的结果。,50,1,、,取材母株的预处理,人工管理，促进母株生长旺盛、代谢活跃，从其上取材培养，容易成功。,2,、,外植体休眠的处理,有些植物的种子、幼胚、或芽，存在休眠。为了打破休眠，可利用低温处理，或赤霉素等化学物质处理。因植物不同处理温度和时间有所不同。,（二）、外植体的处理,51,3,、组织内生菌的处理,（,1,）加入抗生素，注意抗生素的用量，高浓度容易造成培养物的死亡,（,2,）取生长期旺盛的生长点部位作为起始培养的外植体。,（,3,）取被内生菌污染的培养物的 茎尖不停的转接。,52,3.,培养基的成分及其配制,一、培养基的成分及其作用,（一）,无机营养物质,培养的植物组织、器官、细胞或者原生质体需要连续的供给某些无机化学物质，除了,C,、,H,、,O,之外，需要量比较多的元素叫大量元素，需要量比较少的元素叫微量营养元素。,53,培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括,N,P,K,Ca,Mg,S,。培养基中加入量最多的是,N,，,N,一般以硝酸盐或氨盐，或者两者结合的盐提供,大量元素,54,微量元素的用量一般每升不高于几十毫克。植物所需的微量元素有,Fe,、,Cu,、,Zn,、,B,、,Mo,、,Mn,、,Co,，,Cl,其他一些化学药品常带有微量元素杂质，因此要注意微量元素的用量不能过多，多会引起生长抑制等毒害现象。,微量元素,55,（二）,.,有机化合物,有机物质包括维生素类物质、氨基酸类物质、糖类物质和一些其它的有机添加物,1,、维生素类物质,维生素类物质在酶系统中有催化功能。,硫胺素（,VB1,）与愈伤组织的产生和生活力有关，可能是所有植物组织培养初期需要的维生素，而盐酸吡哆醇（,VB6,）促进根的生长，烟酸（,VB3,，又称维生素,PP,）促进胚的发育。有的配方中还使用了泛酸钙（,VB5,）、生物素（,VH,）、钴胺素（,VB12,）、叶酸（,VBc,），,Vc,等。,56,2,、,AA,类物质,绝大多数,AA,适量时对培养效果都有正象效应。常用的有,Gly,、,Asn,、,Gln,。在植物组织培养中，有时也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。,57,3,、糖类,糖在培养基的作用：,1,）、为细胞提供合成新物质的碳骨架,2,）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量,3,）、维持渗透压蔗糖是广泛应用的一种碳源。葡萄糖和麦芽糖也是常用的碳源。,58,4,、其它有机物质,1,）,肌醇（环己六醇）,肌醇可以形成果胶物质，是细胞壁的构建物质另外还可以形成植酸，与阳离子结合或形成磷脂，参与细胞膜的组成。利于胚和芽的形成,2,）,天然有机物,一些天然的有机物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、马铃薯煮汁也常用于植物组织培养，并表现出了良好的促进作用。,59,植物激素是在植物体内合成的，对植物生长发育有显著调节作用的微量有机物，而,植物生长调节,剂是外源的调节植物生长发育的物质。,无机元素和有机营养构成的培养基仅保证培养物的生存与最低生理活动，只有加入植物生长调节物质，才能诱导细胞分裂、脱分化和再分化。,（三）、植物生长调节物质,60,1,、生长素类：,1,）吲哚类：,IAA,（吲哚乙酸）、,IBA,（吲哚丁酸）、,IPA,（吲哚丙酸）,2,）萘酸类：,NAA,（萘乙酸）,3,）苯氧羧酸类：,2,4-D,（,2,4-,二氯苯氧乙酸）、,2,4,5-T,（,2,4,5-,三氯苯氧乙酸）、,2,4,5-T,P,（,2,4,5-,三氯苯氧丙酸）等。,其中吲哚乙酸在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。,61,生长素的生理作用,1,、促进细胞生长和细胞分裂,2,、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力,3,、形成愈伤组织，促进生根,4,、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。,62,A,：,NAA 0mg/L,，芽（少），根（无）,B,：,NAA 0.1mg/L,，芽（少），根（无），愈伤组织（少量）,C,：,NAA 5.0mg/L,，芽（少），根（多），愈伤组织（一定量,A B C,63,2,、细胞分裂素,是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（,6-,糠基氨基嘌呤,KT,）、,6-,苄基氨基嘌呤（,6-BA,）和玉米素（,ZT,）等。其中最常用的是,6,苄基氨基嘌呤。,功能：,1,、促进细胞的分裂和分化,2,、诱导芽的分化,3,、促进侧芽的萌发和生长,4,、抑制衰老,64,A B,A,：,BA(0mg/L),，芽（减少），根（增多）愈伤组织（一定量）,B,：,BA(0.1mg/L),，芽（适量），根（适量）愈伤组织（一定量）,65,控制植物细胞分化,分裂素,/,生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件,比例高时,产生芽,比例低时,产生根,66,生理作用：,1,、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效,2,、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。,IAA/GA,比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化。,3,、破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发。,4,、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用注：不耐热，应采用过滤灭菌加入,3,、赤霉素（,GA,3,）,67,生理作用,：,1,、抑制蛋白质的合成,2,、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、,GA,的作用,3,、诱导休眠、促进衰老和脱落,4,、脱落酸（,ABA,）,68,以上四种生长调节物质，前两类用的多，后两类只是补充，对某些植物有利、对某些植物不仅没有利，还有害，实际工作中要具体分析。生长调节物质在生物体内存在甚微，浓度很低，一般用,ppm,表示,1ppm=1mg/L,69,1,、固化剂 琼脂、琼脂糖（用于原生质体、细胞培养及某些作物的花药培养）琼脂的用量一般在,4-10g/L,，所购回的琼脂要先试一下它的凝固力，一般只要能稳定的凝固就不要多加。琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。,2,、悬浮剂,Ficoll,（聚蔗糖）,（四）固化剂和悬浮剂,70,培养基的种类（根据无机盐的浓度）：,1,、高无机盐含量培养基 钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有,MS,、,LS,、,BL,、,BM,、,ER,培养基。,二、培养基的配方及培养基的选择,71,2,、高硝态氮培养基 硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的,VB1,。主要适合与木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有,B5,、,N6,、,SH,培养基。,72,3,、中等无机盐含量培养基大量元素约为,MS,培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较,MS,的高，维生素种类比,MS,多，如增加了生物素、叶酸等。适合于花药培养，主要有,Nitch,，,NT,、,H,、,Miller,培养基。,73,4,、低无机盐含量培养基大量元素含量大幅度降低而且种类减少，有机含量相对也很低。多数用于生根培养基，主要有,White,、,Heller,、,WS,、,HE,、,HB,。,74,初代培养基,：用来第一次接种外植体的培养基,继代培养基,：用来接种继初代培养物的培养基。,根据培养物的培养过程，培养基分为：,75,根据其作用不同，培养基分为：,诱导培养基增殖培养基生根培养基,76,4,、,根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。,基本培养基,（就是通常称呼的培养基）主要有,MS,、,White,、,N6,、,B5,、改良,MS,、,Heller,、,Nitsh,、,SH,、,Miller,等。,完全培养基,就是基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如生长调节物质和其他复杂有机物质等。,MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5+Su3%+Ag0.7%,77,1,.,无机营养成分,：一般在现有培养基配方中选择。可以参考前人的经验，例如：,MS,是广谱性培养基，,N6,用于单子叶植物的培养。豆科多用,B5,培养基。,2,、,植物生长调节剂,：必须进行筛选试验。总体原则,-,当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。,3,、,有机成分,要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。,培养基的筛选：,78,（一）、贮备液（母液）的配制,为什么要配制母液？,1,）、方便,2,）、准确（有些成分量太小）,三、培养基的配制,79,1,、大量元素母液的配制,各成分按照表,1,培养基浓度含量扩大,10,倍，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到,1000ml,的容量瓶中，即为,10,倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配,1L,培养基取此液,100ml,。,80,注意：,(1),某些无机成分如,Ca,2+,、,SO,4,2,一,、,Mg,2,十,和,H,2,PO,4,一,等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将,Ca,2+,、,SO,4,2,一,、,Mg,2,十,和,H,2,PO,4,一,等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。,(2)CaCl,2,2H,2,O,要在最后单独加入，在溶解,CaCl,2,2H,2,O,时，蒸馏水需加热沸腾，除去水中的,CO,2,，以防沉淀。另外，,CaCl,2,2H,2,O,放入沸水中易沸腾，操作时要防止其溢出。,81,、微量元素母液的配制,MS,培养基的微量元素无机盐由,7,种化合物（除,Fe,）组成。微量元素用量较少，特别是,CuSO,4,5H,2,O,、,CoCl,2,6H,2,O,，因此在配制中分微量,、,配制。按照表,2,，表,3,配方，用感量为,0.0001g,的分析天平称量，其它同大量元素。配制培养基时，每配制,1L,培养基，取微量,10ml,，微量,ml,82,83,3,、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液，如柠檬酸铁，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。配制方法同上，直接用蒸馏水加热搅拌溶解。配制培养基时，配制,1L,取此液,10ml,。,84,在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成,Fe S 0,4,和,Na,2,EDTA,鳌合不彻底，此时若将其冷藏，,Fe S 0,4,会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，,Fe S 0,4,和,Na,2,EDTA,应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色,(,约加热,20-30 min),，调,pH,值至,5.5,，室温放置冷却后，再冷藏。,85,4,、有机母液的配制,MS,培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素。培养基中的有机成分原则上应分别单独配制。配制直接用蒸馏水溶解，注意称量时用电子分析天平。并贮存在棕色无菌瓶中。配制生物素、叶酸，用稀氨水溶解，然后定容。,86,一般植物生长调节剂母液的配制的终浓度以,0.5mg/ml,为好，需要注意的是：（）配制生长素类，例如,IAA,、,NAA,、,2.4-D,、,IBA,，应先用少量,95%,乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用,1mol/L,的,NaOH,溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。以后者效果好。（）细胞分裂素，例如,KT,，应先用少量,95%,乙醇或无水乙醇加,34,滴,1mol/L,的盐酸溶解，或直接用,1mol/L HCl,溶解，再用蒸馏水定容。（）,GA3,以,95%,酒精溶解（不耐高温，过滤灭菌）,保存在棕色试剂瓶中。,5,、植物生长调节剂母液配制,87,注意：所有母液都要贴上标签，注明名称、配制倍数、日期，所有的母液都应保存在,04,冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。,88,在培养基的配制过程中，常需要用氢氧化钾或氢氧化钠和盐酸来来调整培养基的酸碱度：,（,1,）、,1,摩尔,/,升,KOH,液的配制,:,称取,57.1,克,KOH,加蒸馏水至,1000,毫升,.,（,2,）、,1,摩尔,/,升,NaOH,液的配制,:,称取,40,克,NaOH,加蒸馏水至,1000,毫升,.,（,3,）、,1,摩尔,/,升,HCL,液的配制,:,取浓盐酸,(,比重,1.19),、,82.5,毫升加蒸馏水至,1000,毫升,.,配制时先将浓盐酸缓缓加入约,800,毫升的蒸馏水中,然后用蒸馏水补足至,1000,毫升,.,89,1,、计量 根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸取量,ml=,培养基中物质的含量（,mg/L,）,1000ml/,母液浓度（,mg/L,）。,2,、移液取医用瓷缸一只，加入少量的蒸馏水，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用。,（二）、培养基的配制,90,注意（,1,）用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗,2,次。（,2,）量取母液时，不要漏掉或多加。（,3,）移液管不能混用。,91,3,、称取琼脂蔗糖备用,4,、融化用搪瓷量杯量取,600,700ml,的蒸馏水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。,92,5,、混合将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸馏水定容到,1000ml,，来回混合几次。,6,、调,pH,用滴管吸取物质的量浓度为,1 mol/L,的,NaOH,或,HCl,溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的,pH,试纸,(5.4,7.0),测培养基的,pH,，一直到培养基的,pH,达到要求为止,(,在调制时要比目标,pH,值偏高,0.2,0.5,个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，,pH,值会下降,0.2,0.5,个单位左右,),。,93,7,、分装溶化的培养基应该趁热分装。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的,1/5,1/4,。每,1L,培养基，可分装,20,30,瓶。,8,、包扎用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。,9,、培养基的灭菌,94,培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、,pH,值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织,4,培养条件的选择,95,一,.,光照的影响,培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光周期等方面：,光周期：黑暗与光照交替的时间,光 量：光照强度,光 质：光的波长,96,例,1,：黑暗中培养的烟草花药，其胚状体的分化与幼植物的 生长，同经光照培养一样的多例,2,：短日照敏感的葡萄品种，它的茎切段，仅在短日照条 件下才能分化成根例,3,：对日照不敏感的葡萄品种，可在任何光周期下分化成 根结论：光周期的需要与否，应根据植物种类、培养的目的来决定,1,、光周期对植物细胞脱分化和再分化的效应,97,最常用的周期是,16h,的光照，,8h,的黑暗。愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依据植物种类不同做法不同，多数植物适合全暗或周期性光照，器官发生阶段：一般给予周期性光照比较好。,离体培养中光周期的调节,98,光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植物体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。离体培养条件下常用的光量，一般为,1000-4000lx,（勒克斯）。离体培养中通常难以达到,4000lx,，一般光量在,2000-3000lx,。光照强度的高低直接影响器官分化的频率 高光量可以降低植物体内生长素水平，低光量使植物体内生长素素水平较高，容易生根,2,、光量的影响,99,光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，,2,周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种,15,天后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。离体培养条件下，一般用日光灯进行光照，光谱成分主要是蓝紫光，波长为,419-467nm,。对芽分化有效光谱成分为蓝紫光，根分化则受,600-680nm,所刺激。,3,、光质的影响,100,二,.,温度的影响,培养都是在,23,27,之间进行，一般采用,252,。,喜温性植物：茄科、禾本科、兰科等。培养温度一般控制在,26-28,冷凉性植物：百合科、十字花科、菊科等。通常培养温度控制在,18-22,或,25,101,三,.,湿度的影响,组织培养中湿度的影响有两个方面：,一是培养容器内的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。,一是环境的湿度条件。环境的相对湿度一般要求,70,80%,。常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。,102,四,.pH,值,不同的植物对培养基最适,PH,值的要求也是不同的（见表），大多在,5.5-6.5,左右，一般培养基皆要求,5.8,，这基本能适应大多数植物培养的需要。,103,种类,最适,PH,值,种类,最适,PH,值,杜鹃,4.0,月季,5.8,越橘,4.5,胡萝卜、石刁柏,6.0,蚕豆,5.5,桃,7.0,番茄、葡萄,5.7,104,一般来说,PH,值高于,6.5,时，培养基全变硬；低于,5,时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低,PH,值（约,0.2-0.3,个,PH,值）因此在配制时常提高,PH,值,0.2-0.3,单位。,105,五,.,渗透压,培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常,1-2,个大气压对植物生长有促进作用，,2,个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而,5-6,个大气压植物生长就会完全停止，,6,个大气压植物细胞就不能生存,106,培养基各种物质中，糖对培养基渗透压起决定性作用。因此调节渗透压往往从调节糖浓度着手。糖除了作为渗透压调节物质外，还是培养基重要的碳源和能源。另外，甘露醇，山梨醇等也可以作为调节物质。,渗透压调节物质,107,氧气是培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等。,六,.,气体,108,