培养基及其配制.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第3章,培养基及其配制,讲授：白凤麟,2013.09.26,1,培养基的种类,培养基的组成,培养基的配制,本章主要内容,2,培养基形态不同：固体培养基、液体培养基,培养过程不同：初代培养基、继代培养基,其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基,营养水平不同：基本培养基、完全培养基,一,、培养基的种类,3,二、培养基的组成,植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：,a,、组成各种化合物，参与机体的建造，成为,结构,物质；,b,、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；,c,、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳,定、电荷平衡等点化学方面的作用；,d,、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、,器官建成。,4,其它添加物,固化剂,植物生长调节剂,有机营养成分,无机营养成分,培养基组成,无机营养成分,+,有机营养成分,=,基本培养基,5,Arnon,和,Stout,（,1939,）提出的确定植物必需营养元素的,3,个标准,A,、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史。,B,、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复。,C,、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。,6,国内外公认的高等植物所必需的营养元素有,16,（,17,）种：,C,、,H,、,O,、,N,、,P,、,K,、,Ca,、,Mg,、,S,、,Fe,、,B,、,Mn,、,Cu,、,Zn,、,Mo,、,Cl,、（,Ni,）,在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。,7,根据植物体内,含量多少,，可把这些元素分为,大量营养元素,：占干物质重量的,0.1%,以上；,C,、,H,、,O,、,N,、,P,、,K,、,Ca,、,Mg,、,S,9,种,微量营养元素,：占干物质重量的,0.1%,以下,有的只含,0.1mg/kg,Fe,、,B,、,Mn,、,Cu,、,Zn,、,Mo,、,Cl,7,种,按照国际植物生理协会的建议：,所需浓度,0.5mmol/L,的元素为大量元素,所需浓度,0.5mmol/L,的元素为微量元素,8,1,、大量元素,N,是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。,P,是磷脂的主要成分。培养基中常用,KH,2,PO,4,NaH,2,PO,4,等。,K,对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。,9,Mg,、,S,、,Ca,是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；,S,是含,S,氨基酸的蛋白质的组成成分。,Ca,是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，,Ca,及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。,10,2,、微量元素,在微量元素中，,铁,的使用最大：,一些氧化酶的组成成分,叶绿素形成的必要条件,使用乙二胺四乙酸铁（,EDTA-Fe,）鳌合物防止铁的沉淀,11,硼,与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系,铜,是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长,锰,参与植物的光合、呼吸代谢,钼,参与氮素的代谢,氯,是光合作用水光解的活化剂,微量元素的主要作用是作为,酶的辅助因子或激活剂,参与代谢的调节。,12,缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。,桃树,13,缺铜症状：,新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。,枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。,菊花,14,缺锰典型症状：,叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。,菜豆,15,缺钼典型症状：,叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。,十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。,白菜,16,缺硼典型症状：,受精不良,籽粒减少，,“,花而不实,”,，,“,蕾而不花,”,；,根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；,常引起各种腐烂病。,马铃薯,17,3,、碳源,碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以,糖类,物质最重要。,糖类物质特点：,具有热易变的性质,利于吸收和利用,使用浓度一般在,2%,5%,提供能源和调节渗透压,18,4,、维生素类,以各种,辅酶,的形式存在,参与多种代谢活动,对生长，分化等有很好的促进作用,主要分为,脂溶性维生素,和,水溶性维生素,常用维生素有,V,B1,和,V,B6,19,5,、肌醇,环己六醇,细胞壁的构建材料,参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动,促进活性物质发挥作用,20,6,、氨基酸,蛋白质的组成成分,有机氮源,可直接被细胞吸收利用,培养基中常用的是,甘氨酸,7,、天然复合物,促进某些愈伤组织和器官的生长,化学成分不明、复杂,天然营养混合物,如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物,21,8,、琼脂,是使用最普遍的凝固剂,用量一般在,6,10g/L,之间,颜色以浅、透明度高好，洁净为上品,除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。,22,9,、活性炭,吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质,抑制外植体褐变,防止玻璃苗的产生,促进培养物生长和分化,促进生根,缺点：,没有选择性,10,、抗生素,防止外植体内生菌造成的污染,活性炭,23,11,、生长素类,促进细胞伸长和分裂,促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实,诱导愈伤组织形成,溶于,95%,酒精或,0.1mol/L,的,NaOH,中，后者的溶解效果更好,常用的生长素：,IAA(,吲哆乙酸,),NAA(,奈乙酸,),2,4-D(,二氯苯氧乙酸,),IBA(,吲哆丁酸,),24,生长素作用强弱顺序：,IAA,NAA,IBA,2,4-D,强,弱,2,，,4-D,常用于诱导愈伤组织，,IBA,和,NAA,常用于生根,25,12,、细胞分裂素类,促进细胞分裂和分化,诱导胚状体和不定芽的形成,延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成,用于离体成花的调控,溶于,0.5,1.0mol/L,的盐酸或稀薄的,NaOH,中,常用的细胞分裂素：,KT(,激动素,),BA(6-,卞基腺嘌呤,),ZT(,异戊烯氨基嘌呤,),玉米素,26,13,、赤霉素类和脱落酸,A,、赤霉素类,组织培养中不常使用,加速细胞的伸长生长,促进细胞的分裂,主要是,GA,3,B,、脱落酸,抑制细胞分裂和伸长,促进脱落和衰老,促进休眠和提高抗逆能力,27,14、水,作用：,是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。,注意：,用蒸馏水，最好是双蒸水；以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。,28,1,、,MS,培养基,无机盐浓度高,高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐,含有一定数量的铵盐,营养丰富,不需要添加更多的有机附加物,（一）、几种常见培养基的特点,29,（二）、,White,培养基,1943,年由,White,为培养番茄根尖而设计,1963,年作了改良，提高,MgSO,4,的浓度和增加硼元素,无机盐浓度较低,使用广泛,在生根培养、胚胎培养中有良好的效果,30,（三）、,B5,培养基,1968,年由,Gamborg,等为培养大豆根细胞而设计,含有较低的铵盐,较高的硝酸盐和盐酸硫胺素,31,（四）、,N6,培养基,1974,年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计,成分较简单，,KNO3,和（,NH4,）,2SO4,含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他禾谷类植物的花粉和花药培养。,32,AgNO3:,作用：,抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出现,浓度：,1-10mg/L,抗生素：,种类：,青霉素、链霉素、庆大霉素等。,作用：,可防止外植体内生菌污染。,浓度：,5,20mg/L,。,33,1、母液(stock solution)的配制和保存,所谓,母液,是欲配制液的,浓缩液,。,意义,:,保证各物质成分的准确性,配制时的快速移取,便于低温保藏。,三、培养基的配制,34,单配法：,将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用,mg/ml,。,混配法：,将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。,母液配制时可分别配成,大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等,母液的配制方法：,35,培养基母液的配制,36,MS母液配制：,MSI 大量元素 20X,MSII 微量元素 200X,MSIII铁 盐 200X,MSIV有机 物 200X,MSV肌 醇 200X,激 素 0.1mg/ml,37,将,1,、,2,、,4,、,5,称好放入烧杯分别溶解混合，将,3,最后混合，再定容到,1L,，放入试剂瓶贴标签，备用,500mL,甲,1,、,2,、,4,、,5,500mL,乙,3,定容,贴标签,1L,MS,I,X20,2013.9.26,HXH,注：,Ca2+,和,S042-,混合后易沉淀。,38,将,1,7,称好放入烧杯分别溶解混合，定容到,1L,，放入试剂瓶贴标签，备用,1000mL,1,7,定容,贴标签,1L,MS,II,X200,2013.9.26,HXH,39,MS(铁盐),配方用量mg/L,200X（mg）,称量(g),1.FeSO,4,7H,2,O,27.8,5560,5.56,2.Na,2,EDTA2H,2,O,37.3,7460,7.46,将,1,称好放入烧杯甲溶解，将,2,放入烧杯乙溶解，再混合定容到,1L,，放入试剂瓶贴标签，备用,1L,500mL,甲,1,500mL,乙,2,混合定容,贴标签,MS,I,X200,2013.9.26,HXH,40,将,1,、,2,、,3,、,4,称好放入烧杯分别溶解混合，定容到,1L,，放入试剂瓶贴标签，备用,1000mL,1,4,定容,贴标签,1L,MS,IV,X200,2013.9.26,HXH,41,将肌醇称好放入烧杯溶解定容到,1L,，放入试剂瓶贴标签，备用,1000mL,1,溶解定容,贴标签,1L,MS,V,X200,2013.9.26,HXH,42,母液配制时应注意事项：,母液配好后放人冰箱内,低温保存,（4），用时再按比例稀释。,其中III、IV、以及激素类物质应以,棕色瓶,盛装。,母液,使用前摇动瓶子,，如有沉淀、絮状物、微生物污染应停止使用,取样时移液管要,对应取样，,防止交叉污染,43,44,2、培养基的配制,：,MSBA2NAA0.2糖3.0琼脂0.7 pH=5.8,MS：MS I 50 ml,MS II 5 ml,MS III 5 ml,MS IV 5 ml,MS V 5 ml,BA：20ml;NAA：2ml,糖：30g;琼脂：7g,V,贮备液用量,V,配制,/,浓缩倍数,V,激素贮备液,C,激素,*,V,配制,/0.1,mg/ml,45,培养基的选择,培养基基本培养基 植物激素,培养基的选择在实质上讲就是设计营养物质与激素（种类、用量）的最佳组合。,46,筛选培养基常用的试验方法：,单因子试验,多因子试验,逐步添加和逐步排除试验,47,1、单因子试验,只变动一个因子，通过试验找出该因子的影响及影响程度。,如：,MS+BA,2,+,NAA,（0.1、0.5、1.0mg/L）,MS+,BA,+NAA,0.1,（1.0、2.0、3.0 mg/L）,不能反映各种单因子成分之间的组合效果与相互影响,48,2、多因子试验,对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验。,49,2,种激素,5,种浓度的实验组合,（单位：,mg/L,）,例如研究,NAA,和,BA,的最佳浓度组合，每个因子各设,5,个浓度水平，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有,25,项处理的完全试验。,50,3、逐步添加和逐步排除的试验方法,：,成功前-逐步添加（各种营养成分）,实验成功,成功后-逐步排除（减少各种成分）,缩小范围,在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种,加加,减减,的简单方法。,51,科学安排研究顺序,.定基本培养基，激动素,.改良基本培养基,.调整蔗糖、琼脂用量,.改变pH值,.探讨培养的环境条件,52,