苯并芘上调食管鳞癌环氧化酶-2表达诱导M2型巨噬细胞浸润增加机制.pdf

2023 年10 月 第 44 卷 第 5 期 首 都 医 科 大 学 学 报Journal of Capital Medical University Oct.2023Vol.44 No.5基金项目:首都医科大学自然类科研培育基金项目(PYZ22095)。This study was supported by Natural Science Cultivation Fund of Capital Medical University(PYZ22095).Corresponding author,E-mail:agybjcy 网络出版时间:2023-10-19 1615 网络出版地址:https:/ M2 型巨噬细胞浸润增加机制肖泽儒 闫 锐 梁紫葳 葛 洋 安广宇(首都医科大学附属北京朝阳医院肿瘤科,北京 100020)【摘要】目的 研究有吸烟史的食管鳞癌患者肿瘤微环境中 M2 型肿瘤相关巨噬细胞浸润增加的潜在机制。方法通过免疫组织化学法以及免疫浸润分析(CIBERSORT)数据库分析检测 M2 型肿瘤相关巨噬细胞在有/无吸烟史的食管鳞癌患者中表达差异。通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库检测有吸烟史的食管鳞癌患者肿瘤组织中参与调控巨噬细胞招募与极化相关的环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX2)表达变化。使用烟草中主要致癌物苯并芘处理食管鳞癌细胞,通过蛋白印迹(Western blotting)与实时荧光定量聚合酶链反应法(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测 COX2表达变化。通过 Transwell 法评估苯并芘刺激前后对肿瘤细胞上清对巨噬细胞招募作用的影响。构建肿瘤细胞上清-巨噬细胞共培养体系,使用 Western blotting 法与 RT-qPCR 法评估苯并芘刺激前后肿瘤细胞上清对巨噬细胞 M2 型标志物表达变化。通过观察巨噬细胞形态变化辅助判断其极化情况。结果 有吸烟史的食管鳞癌患者 M2 型巨噬细胞浸润明显升高;在烟草中主要致癌物苯并芘刺激下,食管鳞癌细胞中 COX2 明显增多;经苯并芘刺激后肿瘤细胞上清对巨噬细胞招募作用明显增强;经苯并芘刺激后肿瘤细胞上清处理巨噬细胞后可诱导其向 M2 型巨噬细胞极化。结论在烟草中主要致癌物苯并芘的刺激下,食管鳞癌细胞可诱导巨噬细胞进入肿瘤微环境并诱导其向 M2 型肿瘤相关巨噬细胞极化。【关键词】食管鳞癌;吸烟;苯并芘;环氧化酶-2;肿瘤相关巨噬细胞【中图分类号】R735.1 【文献标识码】AMajor tobacco carcinogen benzo(a)pyrene induces infiltration of M2 type macrophages by upregulating cyclooxygenase-2 expression in esophageal squamous carcinomaXiao Zeru,Yan Rui,Liang Ziwei,Ge Yang,An Guangyu(Deportment of Oncology,Beijing Chaoyang Hospital,Capital Medical University,Beijing 100020,China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the potential mechanism of increased infiltration of M2 tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment of esophageal squamous carcinoma patients with a history of smoking.MethodsDifferential expression of M2 tumor-associated macrophages in esophageal squamous carcinoma patients with/without a history of smoking was examined by immunohistochemistry and CIBERSORT database analysis.The expression of cyclooxygenase-2(COX2)involved in the regulation of macrophage recruitment and polarization was detected in tumor tissues of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)patients with a history of smoking by The Cancer Genome Atlas(TCGA)database.Esophageal squamous carcinoma cell lines were treated with benzo(a)pyrene,the major carcinogen in tobacco.Changes in the expression of COX2 of ESCC cell lines were detected by Western blotting and real time quantitative PCR(RT-qPCR).The effect on macrophage recruitment by tumor cell conditional medium was assessed by Transwell assay before and after benzo(a)pyrene stimulation.A co-culture system of tumor cell conditional medium and macrophage was established.Western blotting and RT-qPCR were used to evaluate the expression changes of M2 tumor associated macrophages(TAM)markers.Macrophage morphological changes were observed to assist in determining their polarization.ResultsThe infiltration of M2 macrophages was significantly increased in patients with a history of smoking.COX2 was significantly increased in esophageal squamous carcinoma cells stimulated by benzo(a)pyrene,the major carcinogen in tobacco.The recruitment of macrophages by tumor cell conditional medium was significantly increased after stimulation with benzo(a)pyrene.The treatment of macrophages with tumor cell conditional medium after stimulation with benzo(a)pyrene induced their polarization towards M2 macrophages.Conclusions Stimulation of 首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷esophageal squamous carcinoma cell lines with benzo(a)pyrene induces macrophages to enter the tumor microenvironment and induces polarization towards M2 tumor-associated macrophages.【Key words】esophageal squamous cell carcinoma;smoking;benzo(a)pyrene;cyclooxygenase-2;tumor associated macrophages 食管癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,起源于食管内皮细胞,按照病理类型可分为食管鳞癌(esopha-geal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(e-sophageal adenocarcinoma,EAC)1。在我国多以 ES-CC 为主,且发生率与病死率均位居恶性肿瘤前列2。ESCC 的发生与环境、饮食以及生活习惯息息相关,吸烟是 ESCC 最主要的危险因素之一,约 50%的 ESCC 发生可归因于吸烟或长期暴露于烟草中1,3。苯并芘benzo(a)pyrene,BaP属于多环芳香烃家族成员,可在烟草燃烧时生成并释放到空气中,摄入体内后可导致细胞 DNA 损伤、基因突变、激活致癌基因并异常活化多条信号通路,最终促进肿瘤发生、发展4-5。因此,规劝患者戒烟或适当减少吸烟频率以及根据烟草促癌机制寻找适用于此类患者的治疗方法是 ESCC 临床治疗的关键。肿瘤 相 关 巨 噬 细 胞(tumor associated macro-phage,TAM)是肿瘤微环境中最重要的组成部分,占比超过 50%6。可分为 M1 型 TAM(类促炎型)和M2 型 TAM(类抗炎型),其功能和表型差异明显。在肿瘤微环境中以 M2 型 TAM 为主,这群细胞主要通过营造免疫抑制微环境、促进肿瘤血管生成、直接促进肿瘤侵袭与转移等方式推动肿瘤进展,导致患者不良预后7。诸多因素参与调控 TAM 招募与极化。临床研究8表明有吸烟史的肺癌患者肿瘤微环境中M2 型巨噬细胞浸润增多。但吸烟在 ESCC 中是否参与调控 TAM 浸润目前还不清楚。本研究证明了烟草中主要致癌物 BaP 诱导 ESCC 细胞招募 TAM 并诱导其向 M2 型 TAM 转化的机制,为有吸烟史的 ESCC 患者提供了新的治疗思路。1 材料与方法1.1 实验材料细胞 RPMI-1640 培养基购买于以色列 Biological Industries(BI)公司;胎牛血清、青/链霉素混合液(100)、0.25%(质量分数)胰蛋白酶购买于江苏凯基生物公司;RNA 提取试剂 TRIeasy、反转录试剂以及 qPCR SYBR Green Master Mix 购买于上海翌圣生物;引物合成由北京睿博兴科公司完成;放射免疫沉淀测定(radio immunoprecipitation assay,RIPA)组织/细胞快速裂解液、苯甲基磺酰氟(phenyl methane sul-fonyl fluoride,PMSF)、磷酸酶抑制剂、5蛋白上样缓冲液含二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、蛋白 Col-orMixed Protein Marker 均购买于北京索莱宝公司;蛋白印迹(Western blotting)实验、免疫组织化学实验涉及一抗均购买于美国 CST 公司;Western blotting 实验涉及二抗均购买于上海碧云天公司;增强型化学发光试剂(enhanced chemiluminescence,ECL)购买于北京兰博利德公司;免疫组织化学实验涉及二抗、二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色液购买于北京中杉金桥公司;BaP 购买于美国 Sigma 公司;环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX2)特异性抑制剂 Celecoxib、佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)购买于美国 MCE 公司;聚碳酸酯膜细胞插件与支持物(Tran-swell 套件)购买于美国康宁公司。人食管鳞状细胞癌细胞系 Kyse410、人食管鳞状细胞癌细胞系 TE-1、人单核细胞(tohoku hospital pediatrics-1,THP-1)均购买于美国细胞培养物收藏中心(American Type Culture Col-lection,ATCC)。本研究利用的研究信息不含有使受试者的身份被直接识别或通过与其相关的识别物识别的信息,免除伦理审查。1.2 细胞培养Kyse410、TE-1、THP-1 细胞利用 RPMI-1640 完全培养基培养。完全培养基配置方法为每 45 mL 基础培养基+5 mL 胎牛血清+50 L 青/链霉素混合液(100)。细胞于恒温细胞孵育箱内培养,培养环境为 37 ,5%(体积分数)CO2。根据培养基颜色、pH值、以及细胞密度对细胞进行换液或传代。1.3 细胞蛋白提取与 Western blotting 实验使用胰酶消化法收集细胞于 1.5 mL 离心管中用于蛋白提取。蛋白裂解液配置方法为:每 1 mL RIPA组织/细胞快速裂解液+10 L PMSF+10 L 磷酸酶抑制剂。每只 10 cm 细胞培养皿所收集的细胞加入约 150 L 蛋白裂解液,反复吹打,将离心管管置于冰上静置 10 min。随后对细胞进行涡旋,每次5 10 s,间隔 20 30 s,共 5 次。随后于冰面进行超声裂解,直至无明显声音。随后于水平离心机,4 ,12 000 r/min 离心 20 min,收集上清即为细胞蛋白。使用二奎啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)457第 5 期肖泽儒等:苯并芘上调食管鳞癌环氧化酶-2 表达诱导 M2 型巨噬细胞浸润增加机制蛋白定量试剂测定蛋白浓度,并使用 5蛋白上样缓冲溶液将同组蛋白调定至相同浓度。于金属浴中95 加热 10 min,促使蛋白变性,用于 Western blot-ting 实验与蛋白保存。配置聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electro-phoresis,PAGE),加入定量后的细胞蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyac-rylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝胶电泳,条件为 80 V 约 30 min,待蛋白条带分离后,120 V 约 90 min。期间准备用于电转的厚滤纸与聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜,待电泳结束后,由上到下按照滤纸PAGE 凝胶PVDF 膜滤纸的顺序进行电转,条件为 200 mA,90 min。电转结束后,将膜置于封闭专用牛奶中封闭 1 h。封闭结束后 1Tris-HCl-NaCl-Tween 缓冲盐溶液(TBST)洗膜,5 min/次,共 3 次。随后根据 Marker 位置进行裁膜并孵育一抗过夜。次日,将膜置于 1TBST 进行洗膜,5 min/次,共 3 次。再于室温条件下进行二抗 1 h 孵育,1TBST洗膜,5 min/次,共 3 次。最后,用化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)显影液进行 Western blotting的曝光与统计学分析。1.4 RNA 的提取、反转录与实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)如前所述收集细胞于 1.5 mL 无 RNA 酶离心管中用于 RNA 提取,每只 6 cm 细胞培养皿所收集的细胞加入约 1 mL TRIeasy 溶液,吹打混匀后室温静置 5 min。随后加入 200 L 氯仿,颠倒混匀后室温静置 5 min,于水平离心机,4 ,12 000 r/min 离心 10 min。收集上层无色溶液于新 1.5 mL 无 RNA 酶离心管中,加入等体积异丙醇,颠倒混匀后室温静置 10 min,于水平离心机,4 ,12 000 r/min 离心 10 min。弃去上清,加入无 RNA 酶水稀释的 75%(体积分数)乙醇溶液洗涤沉淀,于水平离心机,4 ,7 500 r/min 离心 5 min,重复 2 次。弃去上清,加入无 RNA 酶水溶解沉淀并测定浓度。使用 Hifair 反转录试剂盒,按照说明对 1 g RNA 进行反转录,得到的 cDNA 溶液。使用 Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 试剂,按照说明配置荧光定量 PCR 溶液(20 L)。使用 ABI 7500 PCR 仪对cDNA 进行 RT-qPCR。每组样本设置 3 个复孔,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehy-drogenase,GAPDH)为内参,使用 2-CT法计算基因相对表达量。所需引物序列如表 1。表 1 引物及引物序列Tab.1 primer and primer sequence PrimerPrimer sequenceCOX2F:5-CTGGCGCTCAGCCATACAG-3R:5-CGCACTTATACTGGTCAAATCCC-3CD163F:5-TTTGTCAACTTGAGTCCCTTCAC-3R:5-TCCCGCTACACTTGTTTTCAC-3CD206F:5-TCCGGGTGCTGTTCTCCTA-3R:5-CCAGTCTGTTTTTGATGGCACT-3IL-10F:5-GACTTTAAGGGTTACCTGGGTTG-3R:5-TCACATGCGCCTTGATGTCTG-3GAPDHF:5-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3R:5-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3COX2:cyclooxygenase-2;CD163:cluster of differentiation 163;CD206:cluster of differentiation 206;IL-10:interleukin 10;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.1.5 临床样本收集以及免疫组织化学法按照世界卫生组织定义:每日吸卷烟 1 支以上,连续或累积吸烟超过 6 个月为有吸烟史者,反之为非吸烟史者。收集临床上有/无吸烟史的 ESCC 患者手术肿瘤组织,制备组织切片后于 65 烤箱烘烤 2 h,随后置于二甲苯中脱蜡并于梯度乙醇中水化无水乙醇95%(体积分数)乙醇75%(体积分数)乙醇各 3 min后,自来水冲洗 5 min。按照一抗说明对组织进行抗原修复(微波煮沸后小火继续加热 15 min)。室温冷却后滴加过氧化物酶阻断剂(用于阻断抗体非特异性结合)10 min,随后置于 1TBST 进行浸洗,5 min/次,共 3 次。使用免疫组织化学专用封闭液封闭 1 h,期间按照抗体推荐浓度配置一抗溶液。封闭结束后甩干封闭液并滴加一抗溶液,于 4 过夜孵育。次日,将切片置于 1TBST 进行浸洗,5 min/次,共 3 次。于室温条件下进行二抗孵育 1 h,随后将切片置于 1TBST 进行浸洗,5 min/次,共 3 次。配置 DAB 显色液(每1 mL 底物液滴加1 滴工作液),于显微镜下观察、显色,并适时终止反应。随后进行按照苏木素 30 s水洗分化液 3 s水洗返蓝 15 s水洗顺序进行复染,并依次置于 75%(体积分数)和 95%(体积分数)无水乙醇(各 3 min)进行脱水,最后于二甲苯中透明,中性树胶封片。每张切片由至少 2 位病理科医生进行阳性细胞评分,评分规则为统计阳性细胞占视野全部细胞比例,每张切片随机选取 3 个视野,阳性细胞比例10%557首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷记为高表达。1.6 PMA 刺激单核细胞 THP-1 向巨噬细胞分化将状态良好的 THP-1 细胞平铺于 6 孔板中,细胞密度约 2105个/mL,6 孔板每孔内加入约 2 mL 细胞悬液。随后加入 PMA 溶液,浓度为 50 ng/mL,孵育 48 h。期间观察 THP-1 细胞状态,经 PMA 刺激后约 24 h 开始出现贴壁情况,待细胞完全贴壁后进行肿瘤细胞上清-巨噬细胞共培养。使用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解BaP,配置成 400 mol/L 母液。于 10 cm 细胞培养皿中培养 ESCC 细胞 Kyse410、TE-1,待其处于对数生长期时加入 BaP 母液,浓度调节至 5 mol/L、10 mol/L。培养24 h 后收集细胞并提取细胞蛋白与 RNA;收集上清用于刺激巨噬细胞。将 BaP 刺激肿瘤细胞后的上清分别加入 PMA诱导贴壁后的 THP-1 细胞培养 24 h 后,镜下观察细胞形态改变;收集巨噬细胞并提取蛋白与 RNA,通过检测细胞标志物的变化观察巨噬细胞极化情况。1.7 巨噬细胞招募实验将 2104个由 500 L 无血清培养基重悬的经PMA 诱导贴壁后的 THP-1 细胞经胰酶消化后均匀平铺于 Transwell 上室,下室分别添加 Kyse410 肿瘤细胞上清、Kyse410+5 mol/L BaP 刺激 24 h 后肿瘤细胞上清。培养 24 h 后,弃去上室培养基,1TBST 进行洗涤,共 3 次。依此经无水乙醇固定 15 minTBST 洗涤0.1%(质量分数)结晶紫染色 5 minTBST 洗涤棉签蘸干后,于 10取景显微镜下选取 3个视野拍照并计数、统计。1.8CIBERSORT 数据库分析与癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析通过 TCGA 获取 ESCC 患者信息(https:/xen- R 语言中 Limma 包与CIBERSORT 包分析有无吸烟史的 ESCC 患者免疫微环境浸润情况以及 COX2 表达差异。1.9 统计学方法使用 GraphPad Prism 8.0 作图与数据分析。对于 RT-qPCR 结果首先使用方差分析检验总体是否有统计学意义,之后使用最小显著差异法(least signifi-cant difference,LSD)检验两组间统计学意义。免疫组织化学的结果使用确切概率法检验比较两组之间差异是否具有统计学意义。其余实验结果使用非配对 t 检验比较两组之间差异是否具有统计学意义。所有实验至少经过 3 次独立重复。以 P0.05 为差异具有统计学意义。2 结果2.1 有吸烟史的 ESCC 患者肿瘤微环境中 M2 型巨噬细胞浸润显著增加使用 CIBERSORT 分析有/无吸烟史 ESCC 患者肿瘤微环境中免疫细胞浸润情况后发现:有吸烟史的 ESCC 患者中,TAM 细胞总数以及 M1 型 TAM 总数明显下降,而 M2 型 TAM 细胞总数明显上升(图1A)。图 1 M2 型 TAM 在有吸烟史的 ESCC 患者肿瘤微环境中浸润增多Fig.1 M2 TAM is highly increased in ESCC patients with smoking historyA:CIBERSORT data analysis of TAM expression in tumor tissue of ESCC patients with no smoking history and smoking history;B and C:expression of CD163 in ESCC patients with no smoking history and smoking history by IHC.TAM:tumor associated macrophage;ESCC:esophageal squamous cell carci-noma;CD163:cluster of differentiation 163;IHC:immunohistochemistry;:P0.05;:P0.01;:P0.0001.657第 5 期肖泽儒等:苯并芘上调食管鳞癌环氧化酶-2 表达诱导 M2 型巨噬细胞浸润增加机制为验证数据分析结果,笔者收集有/无吸烟史 ESCC患者手术样本,使用免疫组化法对肿瘤微环境中M2 型 TAMs(以 CD163 为标志物)进行定量并统计。结果显示,有吸烟史与无吸烟史的 ESCC 组织中,CD163 的表达率分别为 75%(15/20)及 20%(4/20);与无吸烟史 ESCC 患者相比,有吸烟史的ESCC 患者 CD163 表达显著增加(图 1B、C),且CD163 主要于细胞核中表达,细胞呈长梭形,围绕以肿瘤实质周围。2.2 BaP 可上调 ESCC 细胞系中 COX2 表达利用 TCGA 数据库提取出有/无吸烟史 ESCC 患者临床信息,将肿瘤组织与正常食管组织进行对比后,发现与影响 TAM 细胞浸润相关的 COX2 的表达含量在有吸烟史的 ESCC 患者中显著升高(图 2A)。图 2 BaP 刺激 ESCC 细胞系中 COX2 升高Fig.2 BaP elevates COX2 expression in ESCC cell linesA:TCGA data analysis of COX2 expression in tumor tissue of ESCC patients with smoking history versus normal esophageal tissue;B and C:expression of COX2 in Kyse410 and TE-1 cells after treated with BaP by Western blotting and RT-qPCR;D:expression of COX2 in ESCC patients with no smoking history and smoking history by IHC.COX2:cyclooxygenase-2;BaP:benzo(a)pyrene;TCGA:The Cancer Genome Atlas;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;DMSO:dimethyl sulfoxide;RT-qPCR:real time quantitative polymerase chain reaction;IHC:immunohistochemistry.NS:no signifi-cance;:P0.01;:P0.001.757首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷 为验证数据分析结果,我们在 ESCC 细胞培养基中加入烟草中主要致癌物 BaP,其终浓度分别为 5 mol/L、10 mol/L。RT-qPCR 分析显示,相较于Kyse410 对照组,Kyse410+5 mol/L BaP 组、Kyse410+10 mol/L BaP 组的 COX2 mRNA 分别升高1.79 倍(t=4.861,P=0.0083)和 3.03 倍(t=12.73,P=0.0002)(图 2B、图 2C 左侧)。Western blotting 检测结果显示,与对照组相比,加入 BaP 后,ESCC 细胞系中 COX2 蛋白表达显著上调(图 2B、图 2C 右侧)。收集有吸烟史与无吸烟史患者的 ESCC 手术样本,免疫组化染色后检测 COX2 表达,结果显示,有吸烟史与无吸烟史患者的 ESCC 手术组织样本中,COX2 的表达率分别为 90%(18/20)及 30%(6/20);与无吸烟史的 ESCC 患者相比,有吸烟史的 ESCC 患者 COX2 表达显著增强(图 2D),COX2 主要表达于肿瘤细胞的细胞质与细胞核。2.3 BaP 激活后的 ESCC 细胞系可招募巨噬细胞为确定 BaP 刺激下的 ESCC 细胞是否能起到招募巨噬细胞进入肿瘤微环境的作用,笔者进行了巨噬细胞招募实验。将经PMA 诱导贴壁的THP-1细胞置于细胞 Transwell 上室,下室分别添加 Kyse410 肿瘤细胞上清、Kyse410+5 mol/L BaP 刺激后肿瘤细胞上清(图3A)。结果显示,PMA 诱导贴壁的 THP-1 细胞在两组穿出的细胞数分别为(60.371.07)个细胞/视野、(99.671.37)个细胞/视野(t=41.84,P0.0001),BaP 刺激 ES-CC 细胞后对巨噬细胞有明显的招募作用(图3B)。为确定 BaP 刺激下的 ESCC 细胞对巨噬细胞的招募作用是否因 COX2 表达升高引起,我们将经 PMA诱导贴壁的 THP-1 细胞置于细胞 Transwell 上室,下室分别添加 Kyse410+5 mol/L BaP 刺激后肿瘤细胞图 3 BaP 刺激后 ESCC 细胞系招募巨噬细胞能力增强Fig.3 ESCC cells upregulate recruitment of macrophages after stimulation of BaPA:the schematic model of macrophage recruitment;B:staining and counting of macrophages recruitment to different conditional medium;C:staining and counting of macrophages recruitment to different conditional medium with/without celecoxib;CM:conditional medium;BaP:benzo(a)pyrene;DMSO:dimethyl sulfoxide;ESCC:esophageal squamous cell carcinoma.:P0.01;:P0.0001.857第 5 期肖泽儒等:苯并芘上调食管鳞癌环氧化酶-2 表达诱导 M2 型巨噬细胞浸润增加机制上清以及 Kyse410+5 mol/L BaP+3 g/mL COX2 抑制剂 Celecoxib 刺激后肿瘤细胞上清。结果显示,PMA 诱导贴壁的 THP-1 细胞在两组穿出的细胞数分别为(138.343.7)个细胞/视野、(328)个细胞/视野(t=4.7,P=0.009 3)(图 3C)。结果提示,使用COX2 特异性抑制剂 Celecoxib 处理肿瘤细胞后对巨噬细胞招募作用减弱,提示 BaP 刺激 ESCC 细胞后对巨噬细胞的招募作用是因 COX2 表达升高引起。2.4 BaP 刺激后的 ESCC 细胞诱导 TAM 向 M2 型极化为确定 BaP 刺激下的 ESCC 细胞是否能影响巨噬细胞极化,我们进行了巨噬细胞-肿瘤细胞上清共培养实验。在经 PMA 诱导贴壁的 THP-1 细胞中分别加入 Kyse410 肿瘤细胞上清、Kyse410+5 mol/L BaP刺激后肿瘤细胞上清(图 4A)。观察巨噬细胞形态,我们发现加入 BaP 刺激后肿瘤细胞上清的巨噬细胞形态为多边形,有毛刺装凸起,为 M2 型巨噬细胞典型特征(图4B)。RT-qPCR 分析显示,与加入 Kyse410 肿瘤细胞上清相比,加入Kyse410+5 mol/L BaP 刺激后肿瘤细胞上清的巨噬细胞中代表 M2 型巨噬细胞的标志物CD163 升高 2.674 倍(t=5.699,P=0.000 1)、CD206 升高1.975 倍(t=3.347,P=0.016 3)、IL-10 升高7.236 倍图 4 BaP 刺激后 ESCC 细胞上清促使 TAM 向 M2 型极化Fig.4 Conditioned medium of ESCC cells after BaP stimulation leads TAM to polarization towards M2 typeA:the schematic model of macrophage treated with conditional medium;B:morphological changes of macrophages treated with different conditional medium;C and D:expression of M2 TAM marker CD163/CD206/IL-10 treated with different conditional medium by Western blotting and RT-qPCR.CM:condition-al medium;BaP:benzo(a)pyrene;DMSO:dimethyl sulfoxide;PMA:phorbol-12-myristate-13-acetate;THP-1:tohoku hospital pediatrics-1;ESCC:e-sophageal squamous cell carcinoma;TAM:tumor associated macrophage;CD163:cluster of differentiation 163;CD206:cluster of differentiation 206;IL-10:interleukin 10;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;RT-qPCR:real time quantitative polymerase chain reaction;:P 0.05;:P0.001;:P0.0001.957首 都 医 科 大 学 学 报第 44 卷(t=21.32,P0.000 1),M2 TAM 标志物表达明显升高(图 4C)。Western blotting 检测结果显示,与加入Kyse410 肿瘤细胞上清相比,加入 Kyse410+5 mol/L BaP 刺激后肿瘤细胞上清后,巨噬细胞中代表 M2 型巨噬细胞的标志物 CD163、CD206、IL-10 蛋白表达显著上调(图 4D)。以上结果均提示 BaP 刺激 ESCC 细胞后,肿瘤细胞上清可促使 TAM 向 M2 型极化。3 讨论吸烟显著增加 ESCC 的发生率与病死率9,并且影响肿瘤传统治疗的疗效,这可能归因于烟草中繁多的化学致癌物长期作用下营造的炎性微环境以及打破免疫反应平衡所致10。Wang 等11收集了有/无吸烟史的 ESCC 患者样本,通过多色免疫组织化学构建免疫微环境景观,发现免疫抑制性细胞-调节性 T细胞(T regular cells,Tregs)在有吸烟史的 ESCC 患者中浸润显著增加,而树突状细胞(dendritic cell,DC)、细胞毒性 T 淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)含量显著减少,提示吸烟可能通过改变 ESCC 免疫微环境构成继而影响其恶性表型以及治疗疗效。而在烟草的诸多致癌物中,BaP 被证实参与多种癌症的发生相关12-14;长期暴露于 BaP 的刺激中可以通过激活多条信号通路参与肿瘤的恶性生物学行为15。因此,明确 BaP 对肿瘤免疫微环境的影响并寻找有效的干预手段,对改善 ESCC 患者预后有重要的临床意义。TAM 是肿瘤免疫微环境中占比最高的免疫细胞亚群,按照功能可将其分为 M1/M2 两种不同亚型。其中起到抑癌作用的 M1 型 TAM 常以 CD86、2 型主要组织相容性复合体(major histocompatibility com-plex,MHC II)作为标志,而起到促癌作用的 M2 型TAM 常以 CD163、CD206 作为标志。潜