Qiagen80004-抽提RNA、蛋白及DNA.doc

实验目的:白三烯受体mRNA的表达

实验方法：（半）定量聚合酶联反应

实验步骤：
一、 抽提RNA

实验器具和材料

1， 实验器具与材料：
（1） 移液枪：1ml、200ul、10ul
（2） 吸头：1ml、200ul、20ul
（3） 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个
（4） EP管1.5ml、2ml、200ul、10ul
（5） 电动匀浆器
（6） 50ml离心管
（7） 饭盒
（8） 冰盒 碎冰
（9）酒精纱布，供清洁桌面和试管架等。

2, 实验器具的处理与准备
（1）金属制品：（镊子等）提前确定组织的重量，如果组织需要分割，还需要一个刀片。
先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）

3， 试剂配制和准备：
（1） DEPC水：直接购买配置好的。DEPC剧毒，购买那些已经高温高压处理去除DEPC的水。
（2）配70％乙醇：用DEPC水和无水乙醇按照3：7的比例配置。实际上，用超纯水配置也可以，因为70％乙醇用来提取蛋白，不涉及RNA降解的问题。
（3） 无水乙醇
（4）  β-ME
（5） DTT
（6）Buffer RLT 、buffer ALO、 Buffer RPE、buffer AW1、buffer AW2、Buffer EB
准备工作： 
1. 在每 1 ml  Buffer RLT  中加入10 ul  β-ME  (加入β-ME的Buffer RLT可在室温下放置1月)。根据实验需要吸取Buffer RLT，不要把 β-ME加到瓶子里。
2. 每1ml buffer ALO中加入8mg DTT。根据实验需要吸取Buffer ALO。
3.  Buffer RPE、buffer AW1、buffer AW2中加入一定体积的无水乙醇。 瓶盖上打钩说明已加入无水乙醇，如果没有打钩，需要加入无水乙醇。
4. buffer RLT可能会有沉淀，必要时可适当加热使其溶解，在室温中保存。
5. 预热Buffer EB至70℃ （此步骤适用于抽提DNA）。

实验步骤：

样本研磨和匀浆。
1. 取组织：30mg、在干净的表面、速度要快。（根据组织重量决定buffer RLT和其他试剂的用量）

2. 研磨组织，在600ul buffer RLT中匀浆化：电动匀浆器。冰上操作。

3. 最大速度离心溶解产物3分钟。用吸量管将上层清液转入放置着Allprep DNA spin column的2ml收集管（紫色柱子）中。轻轻盖上盖子，8000×g  ( or 10000rpm)离心30s。
注意：有时，在3分钟离心后还存在着少量的未溶解的物质，要使这些不可见；确定离心后没有液体残留在column membrane，必要时可重复离心直到液体都通过膜。

4. 将Allprep DNA spin column 放在一个新的2ml收集管中，并且在室温中保存或者在4℃为了之后的DNA提纯。在后面的RNA提纯使用流出液。
注意：不要在室温或者4℃情况下保存Allprep DNA spin column太长时间。不要冰冻柱子。

RNA提纯
5. 在刚才第4步的流出液中加入430ul无水乙醇：250ul（buffer RLT 350ul）或者430ul（buffer RLT 600ul）。用吸量管充分混合。勿离心，马上进入第6步。
注意：若匀浆的液体有所丢失，相应地减少无水乙醇的量。这步可能会产生沉淀物，但是并不影响之后的过程。

6. 将样本（约700ul，包括可能形成的沉淀）加入到RNeasy spin column中（粉色柱子，放在一个2ml的收集管中），轻轻盖上管盖， 8000×g  ( or 10000rpm)离心15s。为了之后的蛋白提纯，将流出液转移到一个2ml 的管子中。
注意：该收集管可在第7步中再使用。如果样本量超过700ul，再离心。

7. 将700ul buffer RW1 加入RNeasy spin column（粉色柱子）中。轻轻盖上管盖，8000×g（or 10000rpm）离心15s。弃掉流出液。收集管继续使用。
注意：在离心后，小心转移RNeasy spin column，以避免column接触到流出液。确定将收集管中是完全空的。

8. 将500ul buffer RPE 加入RNeasy spin column中。轻轻盖上盖子，8000×g（or 10000rpm）离心15s，弃掉流出液，收集管再用。

9. 将500ul buffer RPE 加入RNeasy spin column中。轻轻盖上试管8000×g（or 10000rpm）离心2min。（此次长时间的离心可以使柱子的膜干燥，以保证在RNA洗脱过程中没有乙醇残留。）
注意：在离心后，小心转移RNeasy spin column，以避免柱子接触到流出液。

10. 可选：将RNeasy spin column转到一个新的2ml收集管中，并且弃掉旧的含有流出液的收集管。最大速度离心1分钟。

11. 将RNeasy spin column转到一个新的1.5ml收集管中。直接将30-50ul的Rnase-free water加入柱子的膜中。轻轻盖上盖子，8000×g（or 10000rpm）离心1min以洗脱RNA。

12. 如果预期的RNA产生大于30ug，可以另外再用30-50ul的Rnase-free water重复上一步的操作，或者如果需要高浓度RNA就直接使用上一步的洗出液。上一步的收集管继续使用。提取的RNA：-80℃冻存，但最好直接逆转录成DNA。

蛋白沉淀
13. 在第6步的流出液中加入1倍体积（通常600ul or 1000ul）的buffer APP。用力混匀并在室温中静置10分钟以使蛋白沉淀。

14. 最大速度离心10分钟，用枪小心吸掉上层清液。

15. 在蛋白颗粒中加入500ul 70%的乙醇，最大速度离心1分钟，用枪小心移除上层清液。

16. 在室温下吹干蛋白颗粒，大约5至10分钟。

17. 加入100ul buffer ALO ，并用力混匀以使蛋白颗粒溶解。

18. 在95℃下静置5分钟以使蛋白完全溶解及变性。随后冷却样本。

19. 最大速度离心1分钟。上层-20℃保存，western用；沉淀-20℃保存，备用。

DNA提纯
20. 往之前第4步中的Allprep DNA spin column加入500ul buffer AW1，轻轻盖上管盖， 8000×g  ( or 10000rpm)离心15s。弃掉流出液。Spin column继续使用。

21. 往Allprep DNA spin column加入500ul buffer AW2，轻轻盖上管盖， 最大速度离心2min。
注意：在离心后，小心从收集管中移出Allprep DNA spin column。如果柱子中含有流出液，倒空收集管并再以最大速度离心1分钟。

22. 将Allprep DNA spin column放置到一个新的1.5ml收集管中。直接将100ul buffer EB 加入spin column membrane并关上盖子。在室温中静置2分钟，然后 8000×g  ( or 10000rpm)离心1min以洗脱DNA。

23. 重复上一步。
注意：使用新的1.5ml收集管来收集第二次的DNA洗出液。重复使用上一步的收集管使两次洗出液混合。
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit可从同一细胞或组织样本中同时纯化基因组DNA、总RNA和总蛋白质，使样本制备流程流畅高效（参见流程图"AllPrep DNA/RNA/Protein procedure"）。使用此试剂盒无需在纯化前将样本分为三份，因此DNA、RNA和蛋白质的回收水平达到最高。此外，纯化过程中无需使用酚和丙酮等有机溶剂。
细胞或组织样本首先在Buffer RLT中裂解，使得DNA酶、RNA酶和蛋白酶立刻失活，确保可分离得到完整的DNA、RNA和蛋白质。用AllPrep DNA离心柱过滤裂解液。使用该离心柱和高盐缓冲液可高效的选择性结合基因组DNA。洗脱之后即可得到即用型DNA。
在AllPrep DNA离心柱的流出液中加入乙醇，形成适合RNA结合的条件。用RNeasy离心柱过滤样本，总RNA与膜结合，污染物被去除。然后用不含RNA酶的纯水进行洗脱，得到高品质RNA。
Buffer APP是新型的水溶性蛋白沉淀溶液。将其加入RNeasy离心柱的流出液中，然后离心得到蛋白质沉淀。用适合的溶液溶解完整的总蛋白质，即可直接用于下游应用。此试剂盒包括Buffer ALO，该缓冲液用于溶解蛋白沉淀，不影响SDS-PAGE操作。
应用
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit标准化了系统生物学研究中的样本制备过程。DNA、RNA和蛋白质为同一来源，减少了从不同样本中制备这些分析物时引起的内在差异。