碱性枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选.doc

碱性枯草芽孢杆菌发酵过程控制及最优碳源筛选
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（+++++农业与生物技术学院 ++ 111111）
摘要：本实验通过福林试剂法检测枯草芽孢杆菌中碱性蛋白酶的活性，旨在筛选出培养枯草芽孢杆菌时的最优碳源和掌握培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制，为今后进一步提高枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶提供可靠地参考数据。
关键词：酶活、最优碳源、碱性蛋白酶。
引言：碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9～11,属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类,除可催化蛋白质水解为氨基酸外,在有机溶剂中还可催化多肽的合成[1]。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用,吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究[2]。微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,同时易于实现工业化生产[3]。而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性且有一定的酯酶活力[4]。枯草芽孢杆菌是生产碱性蛋白酶的传统菌株,具有产蛋白酶量大,耐高温、高碱等特点,因此对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点[5]。我国研究和生产的碱性蛋白酶的活力水平虽然不断提高,但大多数采用进口的碱性蛋白酶制剂,并且大规模工业生产中用的碱性蛋白酶还是主要依赖进口[6]。本实验通过碳源优化枯草芽孢杆菌发酵培养基和探究培养枯草芽孢杆菌基本的发酵过程控制,以期进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。
1. 材料与方法
1.1 菌株：枯草芽孢杆菌
1.2 材料与试剂
酪氨酸、福林试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素、氯化钙、酵母浸粉、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、蛋白胨
1.3 仪器与设备
恒温水浴锅、分光光度计、高速离心机、摇床、超净工作台、15L发酵罐、PHS-25型酸度计、振荡培养箱、压力灭菌锅。
1.4 培养基
种子培养基(g/L)：胰蛋白栋5g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉5g/L、K2HPO4 18g/L ,pH 值自然，121℃蒸气灭菌20min；
发酵培养基(g/L)：酵母浸粉10 g/L、糊精100 g/L、柠檬酸钠3 g/L、蔗糖20 g/L 、K2HPO4 18g/L 、CaCl2 3 g/L, pH 值自然，115℃与发酵罐一起进行实消，20min。
1.5方法
1.5.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌的影响
1.5.1.1配制培养基（20mL/150mL）
准确秤取0.2g酵母浸粉、0.06g柠檬酸钠、0.2g磷酸氢二钾、0.06g 氯化钙5份分别加入0.6g蔗糖、0.6g麦芽糖、0.6g葡萄糖、1.1g乳糖、1.1g糊精，最后取20mL自来水，PH自然，配制成20ML/150mL的培养基，塞好棉塞，包扎后进行高压真气灭菌（121℃蒸气灭菌20min）
1.5.1.2 接种
用移液枪吸取0.62mL菌种至培养基上，置摇床35℃，200r/min恒温培养48h。将发酵液12000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。
1.5.1.3 酶活力的测定
1.5.1.3.1标准曲线的制作
取12支试管，按表1加入试剂（每支重复一次），混匀，再加入1mL福林试剂摇匀，置40℃水浴20min，于分光光度计680nm处测定样品的A680值。以不含酪氨酸的0号管作为空白。
表 1 标准曲线制备试剂
管号 酪氨酸浓度 酪氨酸使用 水/mL 0.4moL/L
( µg/ML ) 溶液( µg/ML ) NaCO3
0 0 0.0 1.0 5
1 10 0.1 0.9 5
2 20 0.2 0.8 5
3 30 0.3 0.7 5
4 40 0.4 0.6 5
5 50 0.5 0.5 5
1.5.1.3.2样品酶活测定方法
取碱性蛋白酶的菌种发酵液10mL于离心管中，12000r/min离心15min后，分别吸取上清液1mL稀释至10、25、50倍。取试管7支（一支为空白管，样品重复2次），各加入稀释好的样品1mL，40℃水浴预热3min,再加入同样预热过的1%酪蛋白液1mL,精确反应10min,加0.4moL/L三氯乙酸2mL终止反应混匀，水浴沉淀15min后过滤，吸滤液1ML,加入0.4moL/L Na2CO3 5mL混匀，再加入1mL福林试剂摇匀，置40℃水浴20min。
空白测定同上，但在加酪蛋白之前先加0.4moL/L三氯乙酸2mL。以空白对照，用分光光度计680nm波长下测样品的A680，选出最优碳源。
1.5.2 对枯草芽孢杆菌发酵过程控制的探究
1.5.2.1按实验材料中种子培养基的组分制备好种子培养基，控温到接菌温度时，进行接菌。接菌后置于摇床上培养24h，备用。
1.5.2.2按实验材料中发酵培养基的组分制备好发酵培养基，进行电极（PH电极、溶氧电极）标定。将制备好的发酵液由进料口加料，然后在115℃下实消20min。
1.5.2.3降温到接菌温度接菌，控制变温恒溶氧条件进行发酵。
1.5.2.4 发酵过程控制前基本参数记录，发酵过程直接参数记录，发酵离线参数记录。
1.5.2.5根据记录数据进行发酵全过程分析，得出结论。
2.结果与分析
2.1 图1为碱性蛋白酶活力测定标准曲线，由R2=0.9996可知该标准曲线置信度高，能用它的方程y=0.0092x-0.0015求吸光常数K。图中的y即为吸光度，当y=1时，由酶活计算公式X= A680×K×4×N/10得x=108.86µg/mL。
图1 碱性蛋白酶活力测定标准曲线
y = 109.2x + 0.1752
R
2
= 0.9996
0
10
20
30
40
50
60
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
吸光值
酪氨酸浓度(μg/mL)

2.2 表1 为枯草芽孢杆菌生长在5种碳源下的A680值，由酶活计算公式X= A680×K×4×N/10得乳糖为最优碳源，蔗糖次之。
表1 5种碳源下的A680值
碳源 稀释50倍时的A680值 稀释50倍时的A680值
麦芽糖 0.379 0.250
糊精 0.355 0.259
乳糖 0.466 0.268
葡萄糖 0.374 0.256
蔗糖 0.390 0.262
2.3.1图2枯草芽孢杆菌发酵过程部分参数图（因为接种后12h，才开始对发酵数据进行记录并整理分析，所以该图只反映发酵过程的部分）。
2.3.2发酵罐从接种开始发酵，前14h无数据记录，为了作图方便将第14h，在图1横坐标标为00：01，特此说明。
2.3.3发酵过程控制的是最优碳源次之的蔗糖在变温恒溶氧条件下，进行的枯草芽孢杆菌发酵碱性蛋白酶的探究。
2.3.4图2中的OD600可以反映发酵过程菌体的生长情况，酶活可以反映菌体的生产情况。本实验将溶氧和转速偶联在一起，所以转速的高低也就反映了菌体呼吸强度的大小。实验中的所有参数分析如下：
2.3.4.1 OD600反映菌浓。当第一次（也即开始发酵第14h）记录数据时，OD600达到0.983。第二次记录数据时OD600突然减小到0.273，缘于发酵开始第12h，加入消泡剂（植物油）过量，大多菌因为猛然的供氧不足造成大批菌体死亡。随着基质中蔗糖的浓度降低经历了4h后部分菌开始利用消泡剂作为碳源，致使第三次OD600又显著上升至0.988。之后，OD600又逐渐下降，但并非消泡剂被耗光。若消泡剂耗光菌体发酵产生的酶蛋白必然使得发酵罐中泡沫上升，但在后续试验中并未观察到这一现象。说明氮源或者其他营养成分短缺，成为了菌体生长的限制因子。
2.3.4.2酶活反映菌的生产能力。酶属于初级代谢产物，主要产生于对数期。由于受消泡剂影响，歪打正着，为我组实验创造了新的对数期（图1中的02：06~04：03），此时，随着OD600上升，酶活也在上升，再次验证了酶属于初级代谢产物，主产于对数期。之后随着培养条件恶化，酶开始失活。再后来，酶又开始上升的原因是部分菌发生变异，开始利用产物酶作为氮源（也即证实了大批量菌死亡的缘故是培养基中可利用氮源酵母浸粉的匮乏），菌体浓度OD600和酶活又开始缓慢上升。
2.3.4.3转速反映菌体代谢强度。对数生长期是进行物质大量合成的时期，枯草芽孢杆菌为需氧型菌，需要氧化反应提供ATP的合成，发酵后期的呼吸强度应有所降低，但后期菌体量大，所以耗氧量也大。
2.3.4.4本实验DO%与转速偶联，再不必分析。从记录数据时温度恒定，也不比分析。
2.3.4.5本实验中的PH由表2发酵过程各项参数可知，总体来看从5.56~7.39，说明碱性蛋白酶对培养基PH有较为显著的提高，今后做实验要慎重考虑。
表2 发酵过程各项参数
时间 温度℃ 转速r/min OD600×10-3 DO% PH 稀释倍数 酶活U/ML
00:01 32 257 0.983 28.6 5.56 25 319.85
02:06 31.9 603 0.273 27.6 6.25 25 499.23
04:03 32 751 0.988 24.4 6.67 25 847.25
06:00 31.8 583 0.853 28.3 7.03 25 377.28
08:00 31.9 551 0.228 27.4 7.66 25 422.19
10:01 31.9 509 0.087 28.8 7.54 25 396.13
11:58 31.9 487 0.114 29 6.97 25 391.56
13:48 31.9 451 0.247 30.5 6.98 25 444.06
22:00 31.9 325 0.136 33.7 6.43 25 531.12
23:59 31.9 366 0.212 34.1 7.39 25 651.88

3.结论
3.1采用枯草芽孢杆菌为发酵菌株，用枯草芽孢杆菌生长在5种碳源下的A680值，由酶活计算公式X= A680×K×4×N/10得乳糖为最优碳源，蔗糖次之。
3.2 确定了最佳培养基配方和最适发酵条件，最后得到最佳培养基为酵母浸粉10 g/L、糊精100 g/L、柠檬酸钠3 g/L、蔗糖20 g/L 、K2HPO4 18g/L 、CaCl2 3 g/L, pH 值自然，最佳培养条件为变温恒溶氧发酵36h，碱性蛋白酶酶活力可达847.25U/mL。