博舒替尼对大鼠脑缺血_再灌注损伤的影响.pdf

博舒替尼对大鼠脑缺血 再灌注损伤的影响张艺，吴超，张奇，孔钰，卞晓倩，王影，李曙（皖南医学院研究生学院；皖南医学院基础医学院，安徽 芜湖 ；芜湖市第二人民医院 老年医学科，安徽 芜湖 ；皖南医学院公共卫生学院；皖南医学院临床医学院，安徽 芜湖 ）【摘要】目的：探索博舒替尼（）对大鼠脑缺血 再灌注损伤早期的干预作用。方法：只 大鼠随机分成 组（随机数字法），每组 只，设 组（对照组）：只分离颈部血管，不做其他处理；（模型组）：采用改良线栓法制作大鼠脑缺血 再灌注损伤模型，缺血 后再灌注 ；组（溶剂组）：实验前 尾静脉注射溶剂 （），脑缺血 再灌 ；组（干预组）；实验前 予以尾静脉注射现配的 （），脑缺血 再灌 。缺血 再灌注 后，进行神经功能评分；用 染色后计算脑梗死面积；法检测 蛋白表达水平；检测脑组织中细胞因子 、含量。结果：神经功能评分，与 组比较，及 组的评分显著升高（）；与 及 两组比较，组的评分显著下降（）。脑梗死体积，与 组对比，及 组梗死体积百分比均显著增大（）；与 及 两组相比较，组脑梗死体积百分比显著减少（）。的蛋白表达，与 组比较，及 组的 蛋白表达无显著变化（）；与 及 比较，组 蛋白表达显著下降（）。炎症因子变化，与 组对比，组及 组的 、含量均显著升高（）；与 组及 组比较，组 、含量均显著下降（）。结论：可减少脑缺血 再灌注引起的损伤，其可能机制与抑制 蛋白及炎症因子的表达有关。【关键词】博苏替尼；脑缺血 再灌注损伤；炎症【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）【】，（，；，；，）【】：（），；（）：；（）：，；（）：（），；（）：，（），；：，（），（），（）；，（）：，【】；【基金项目】安徽省高校科学研究重大项目（）；年高校优秀拔尖人才培育资助项目（）；皖南医学院中青年课题（，）；安徽省大学生创新创业训练计划（）【收稿日期】【修回日期】【通讯作者】：；：脑卒中为一种与衰老相关的严重脑血管疾病，约 的脑卒中为缺血性卒中 。脑缺血后，血管再通，继而脑组织再灌注，一般会导致继发性脑损伤，称之为脑缺血 再灌注损伤（，）。炎症反应是 的重要诱发因素之一，促炎因子激活神经元和血管内皮中国应用生理学杂志，（）细胞，释放活性氧（，）和蛋白水解酶等，介导微血管功能障碍，破坏血脑屏障导致血浆纤连蛋白和纤维原蛋白渗入脑组织，加重神经元凋亡和坏死 ，因此，有效地抑制炎症因子释放或许有助于缓解 。盐诱导激酶（，），已知它属于丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶。既往研究发现，盐诱导激酶 （）与脑缺血 再灌注损伤的发生发展密切相关 。此外，可能参与脑出血（，）后的炎症反应 ；盐诱导激酶（）已被提议作为开发炎症性肠疾病治疗应用的靶点 ，而 是一种酪氨酸酶抑制剂，被 批准用于治疗成人慢性粒细胞性白血病，其可以抑制 ，。本课题组前期研究表明，在脑缺血 再灌注损伤早期呈动态变化，而有关 对大鼠脑缺血 再灌注损伤早期的干预作用，尤其是 能否通过抑制 表达以减轻脑缺血 再灌注后的炎症反应及脑损伤的相关研究，鲜有报道，本文探究 对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响，旨在为对脑缺血 再灌注后损伤的干预提供靶点；为脑缺血 再灌注损伤的治疗提供指导。材料与方法 实验动物及分组 周的 雄性大鼠（济南朋悦公司 （鲁）。所有大鼠自然光照饲养 周，正常饮食，体重在 。大鼠分四组（随机数字法），每组 只。组：只分离血管不插栓，不做其他处理；：缺血 后再灌注 ；组：实验前 ，尾静脉注射 （），脑缺血 再灌 ；组：根据前期实验结果，实验前 尾静脉注射 （）（按说明书 溶于 配置成浓度 ），脑缺血 再灌 。主要材料 级栓线（购于深圳市瑞沃德公司）；二甲基亚砜（）；，三苯基氯化四氮唑（）试剂（购于 上 海 源 叶 公 司）；及 试 剂 盒（）（购于索莱宝公司）；兔多克隆抗体抗 （购于博奥森）；兔多克隆抗体抗 （购于合肥白鲨公司）；多功能酶标仪（购于美谷分子仪器公司）。建立 大鼠模型实验前大鼠禁食 ，。参照改良 法制备大鼠脑缺血再灌注模型：新鲜配置的 水合氯醛（）腹腔注射麻醉，颈部常规消毒，分离皮下软组织，暴露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，分离颈外动脉主干，在其远端 左右处结扎并离断切断，近心端打结；动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉，剪刀于颈外动脉游离端与固定线间剪一小切口，插入 级栓线进入颈内动脉，于标记处停止进栓。缺血 后，将栓线轻轻拔出至颈总动脉。组不插入栓线，余步骤同模型组。评分法检测大鼠神经功能脑缺血 再灌 后评估神经功能，标准如下：可正常活动，分；手术对侧前肢呈部分伸直，分；行走时向手术对侧转弯，分；如果出现向手术对侧跌倒并且呈跛行，分；不能主动行走，或有意识丧失表现，分。分表示建模成功。随后拔出线栓，并进行再灌注。再灌注 后取脑，超低温冰箱冻存或 多聚甲醛浸泡室温放置。染色计算大鼠脑组织梗死体积评分后，麻醉后取脑，用 生理盐水去除组织上的血液，放于载玻片上放入 冰箱冰冻 ，与此同时配制 染液，然后沿冠状面切成 厚度的薄片 片，避光置于 溶液，恒温水箱加热 。染色结束后取出标本置于 甲醛溶液中固定，第 日滤纸吸干水分后置于蓝色背景下拍照。用 软件测量脑梗死面积，然后计算梗死体积，梗死体积百分比 脑梗死侧梗死体积 对侧脑体积 。蛋白质印迹法检测 脑组织放入 离心管中（全程冰上操作）；加入 裂解液（体积比 裂解液 ）在组织匀浆机中低温研磨组织，次。使其充分裂解，离心 后将 管上清液转移至另一 管中。根据 试剂盒说明书步骤测定蛋白浓度，保证各组上样量一致。蛋白样品变性提取的蛋白溶液用 上样缓冲液，按照 ：体积比配置成蛋白样品，震荡器上充分振荡混匀，置于金属加热器中加热 使其充分变性，冷却后放置于 冰箱中保持待用。按照说明配制凝胶，经上样、电泳、转膜后，先后加入兔抗 一抗（）和兔抗 一抗（：），冰箱，摇床中过夜。第二天取出条带，清洗后放入配置好的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 二抗（）孵育，曝光条带，用 软件测算其灰度值，计算 的灰度值比值。，（）法检测脑组织 及 提取取梗死区脑组织，按照试剂盒说明书步骤提取脑组织匀浆，加入一定量事先预冷的磷酸盐缓冲液（每 脑组织加入 磷酸盐缓冲液），低温研磨后离心，取上清液备用；按试剂盒说明书方法检测脑组织 及 的浓度，再计算其相应的质量分数。统计学处理应用 软件（）做统计学分析。呈正态分布的数据，用均数 标准差（珋 ）表示，多组间比较采用方差分析（组间两两比较采用 法）。结果 对大鼠神经功能评分的影响神经功能评分结果显示，与 组评分（）比较，组评分（）和 组评分（）评分均显著增加（）；与 及 两组比较，组评分（）评分显著下降（）。对大鼠脑组织梗死体积百分比的影响 组未见脑梗死（）（图 ）；与 组相比，组（）及 组（）脑梗死体积百分比均显著增加（）；与 组及 组相比较，组（）脑梗死体积百分比明显减少（）。：；：；：；：对脑组织中 的蛋白表达的影响与 组比较，及 组 的蛋白表达量相对减少，但无统计学差异（）；与 及 组比较，组 的蛋白表达量显著减少（，表 ）。（）（）对大鼠脑组织 及 含量的影响与 组对比，组及 组的 及 含量均显著升高（）；与 组和 组比较，组 、浓度均显著下降（，表 ）。，（珋 ，）（）（）；讨论 的发生发展与自由基损伤、超载、细胞凋亡和炎症反应等密切相关，导致血脑屏障破坏以及脑神经元坏死。脑缺血后，血管再通导致的脑功能障碍因素有很多种，炎症反应是其中的重要原因之一 ，。后脑组织缺血缺氧，血脑屏障破坏，脑梗死面积增加，神经功能缺损及功能的改变 ，我们课题组前期研究发现 ，与大鼠 后的梗死面积相关，本研究中构建了大鼠脑缺血 再灌注模型，并给予 （抑制剂）干预。既往研究表明 与脑缺血 再灌注损伤密切相关 ，在神经元细胞中高度表达，其基因被敲除后，后神经损伤可显著减轻，表明 是缺血性神经元损伤的重要分子调节因子；本研究结果显示模型组大鼠脑梗死面积以及神经评分较假手术组显著升高，与前人 研究结果一致。与模型组比较，组的 表达显著下降，脑梗死面积及神经评分亦显著下降。等研究发现 盐诱导激酶（）参与脑出血后的炎症反应。已知 参与了 ，但是否参与了 后的炎症反应，目前尚不清楚。中性粒细胞等是 的主要细胞，它们释放大量炎症因子，其中 是炎症因子的中国应用生理学杂志，（）启动因子，、的产生也可以促进一氧化氮合成酶的增多，进而加重炎症反应 。可以诱导脑缺血区中性粒细胞在微血管黏附、聚集，随后触发细胞凋亡，同时也上调其他炎症因子 。脑缺血 再灌注的早期，升高，在缺血 再灌注 小时前予以侧脑室注射 可加重脑损伤 ，而 抑制剂，可以改善血脑屏障的破坏和中风损伤 ，。可在缺血性脑损伤等中枢神经系统疾病中大量表达，并且是疾病损伤程度的重要指标 ，。本研究中，及 组的 、浓度均较 组显著升高（），而 组较模型组和介质组明显下降（）。相关研究提示 可通过 途径，抑制炎症反应 。综上结果表明，可以改善 后的脑梗死面积、神经功能评分以及抑制 、的表达，其机制可能是通过抑制 蛋白的表达实现。研究不足之处，未检测 及 的表达。综上所述，作为酪氨酸激酶抑制剂，其可能通过抑制 的表达以减少 、等炎症因子的生成，从而减轻脑缺血 再灌注后引起的损伤，而 调节炎症通路的机制，可能为减轻脑缺血 再灌注损伤提供新的思路。【参考文献】，（）：，：，：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：孙科，罗招亮，胡琛，等小檗碱对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及免疫机制 中国应用生理学杂志，（）：吴超 对脑缺血再灌注损伤的影响及机制研究：皖南医学院，（）：，：，（）：，（）：，（）：张莉莉，王景周，周华东，等肿瘤坏死因子 在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用机制 中华老年医学杂志，（）：（下转第 页），（），（）：，（）：，（）：，（）：袁芬七氟烷对新生大鼠学习记忆功能以及海马区凋亡的影响 中国免疫学杂志，（）：王锋，朱瑾，张素雅，等绿茶多酚对帕金森大鼠神经保护作用及对 信号通路的影响 医学分子生物学杂志，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：韩佳，欧册华地塞米松对七氟烷致麻醉致新生大鼠记忆障碍及神经元损伤的影响 四川大学学报（医学版），（）：，（）：，（）：，（）：孙杨，赵灿，刘媛媛，等辣木叶对糖尿病大鼠认知功能及海马神经细胞凋亡的影响 中国应用生理学杂志，（）：王瑜，何施燕，朱若婷，等紫草素对肝癌细胞 凋亡的影响及其机制 中国应用生理学杂志，（）：，（）：（上接第 页）李俊杰，蒋海燕，邵建林脑缺血 再灌注损伤大鼠脑组织中 ，和 的表达 昆明医科大学学报，（）：，（）：，（），（）：常红恩，郑娜，安红伟，等通窍活血汤对大鼠脑缺血再灌注损伤后血清中 及 水平的影响 成都中医药大学学报，（）：，（），（）：中国应用生理学杂志，（）