NEFA对牛骨骼肌细胞线粒体功能及脂肪酸代谢相关基因的影响.pdf

7期2115NEFA对牛骨骼肌细胞线粒体功能及脂肪酸代谢相关基因的影响黄泳，杨艺，赵颖，付叶，龚婷*（贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点试验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点试验室，贵州贵阳550025）摘要：【目的】明确非脂化脂肪酸（NEFA）胁迫对牛骨骼肌细胞线粒体功能及脂肪酸代谢过程的影响，为揭示围产期奶牛营养代谢病的作用机理提供参考依据。【方法】建立NEFA胁迫牛骨骼肌细胞模型，经最佳浓度时间组合刺激后，采用透射电镜观察牛骨骼肌细胞线粒体的形态变化，通过油红O染色及BODIPY 493/503染色观察细胞内脂质沉积情况，采用流式细胞术检测线粒体膜电位，利用试剂盒检测细胞内的过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量，并以实时荧光定量PCR检测线粒体功能及脂质代谢相关基因表达情况。【结果】综合NEFA对牛骨骼肌细胞存活率及其形态的影响，选取1.5 mmol/L NEFA刺激2 h作为后续试验的最佳浓度时间组合。经1.5 mmol/L NEFA刺激2 h后，牛骨骼肌细胞线粒体体积变小、基质颜色加深，线粒体嵴排列紊乱，且趋向于融合现象，甚至部分呈空泡状；线粒体膜电位下降的细胞数量明显增多，较对照组（刺激0 h）显著提高38.08%（P0.05，下同）；细胞培养上清液MDA含量较对照组（刺激0 h）显著提高1.38倍，而细胞内的CAT活性极显著降低60.63%（P0.01，下同），SOD活性显著降低34.21%。实时荧光定量PCR检测结果显示，经1.5 mmol/L NEFA刺激2 h后，调控线粒体基因复制与转录的NRF1和PGC-1基因、调控线粒体融合的MFN2基因、线粒体呼吸链关键酶基因（除COV基因外）、含Patatin样磷脂酶域2蛋白基因（PNPLA2）及长链脂酸延伸酶6基因（ELOVL6）的相对表达量均极显著降低，而肉毒碱脂酰转移酶1B基因（CPT1B）的相对表达量极显著提高。【结论】高浓度的NEFA对牛骨骼肌细胞具有脂毒性，对线粒体形态、功能与膜电位均产生影响，能引发线粒体功能障碍及导致细胞脂肪酸代谢异常，产生氧化应激，进而诱导脂质异常沉积。关键词：牛；围产期；非酯化脂肪酸（NEFA）；骨骼肌细胞；线粒体功能；代谢异常中图分类号：S823.91文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）07-2115-11收稿日期：2022-12-29基金项目：国家自然科学基金项目（32002205）；贵州省科学技术基金重点项目（黔科合基础 2020 1Z028）；动物营养学国家重点实验室面上项目（2004DA125184F1902）通讯作者：龚婷（1990-），https:/orcid.org/0000-0003-3624-7972，博士，副教授，主要从事动物遗传育种与繁殖研究工作，E-mail：第一作者：黄泳（1997-），https:/orcid.org/0000-0002-0802-036X，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（7）：2115-2125ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.07.023Effects of NEFA on mitochondrial function and fatty acidmetabolism related genes in bovine skeletal muscle cellsHUANG Yong，YANG Yi，ZHAO Ying，FU Ye，GONG Ting*（College ofAnimal Science，Guizhou University/Key Laboratory ofAnimal Genetics，Breeding and Reproduction inthe Plateau Mountainous Region，Ministry of Education/Guizhou Key Laboratory ofAnimal Genetics，Breeding andReproduction，Guiyang，Guizhou 550025，China）Abstract：【Objective】To investigate the effects of non-esterified fatty acid（NEFA）stress on mitochondria functionand fatty acid metabolic processes of bovine skeletal muscle cells，and to provide reference for revealing the mechanismof nutritional metabolic diseases in cows in the perinatal period.【Method】A NEFA-stressed bovine skeletal muscle cellmodel was established.After the optimal combination of concentration and time stimulation，mitochondrial morphologicalchanges were observed by transmission electron microscopy，lipid deposition was observed by oil red O staining andBODIPY 493/503 staining，and mitochondrial membrane potential was detected by flow cytometry.The activities of cata-lase（CAT）and superoxide dismutase（SOD）and the content of malondialdehyde（MDA）were detected by the kit.The54卷南 方 农 业 学 报 21160引言【研究意义】围产期（产犊前3周至产后3周）奶牛将经历强烈的生理和营养代谢变化，由于产前胎儿对瘤胃的物理性压迫，同时受营养代谢、激素等诸多因素的影响，奶牛干物质采食量（Dry matter intake，DMI）显著下降（Bertics et al.，1992）。此外，由于胎儿发育及奶牛分泌乳汁等代谢活动所需能量大幅上升，因此体内原有的能量平衡被打乱，此时机体极易出现能量负平衡（Vanholder et al.，2014；张帆等，2020）。当机体能量失衡时，机体将动员体脂以维持能量平衡状态（Koltes et al.，2017），进而引起机体血液中的非脂化脂肪酸（Non-esterified fatty acid，NEFA）含量迅速增加，但肝脏的NEFA代谢能力有限，最终导致多余的NEFA进入血液而产生高NEFA血症。因此，探究高NEFA胁迫下牛骨骼肌细胞线粒体功能及其脂肪酸代谢的变化，对解析骨骼肌在奶牛围产期发挥的作用机理具有重要意义。【前人研究进展】骨骼肌是奶牛体内最大的器官及蛋白储存的主要场所，但与外周血和肝脏相比，有关其在围产期发挥作用及所受影响的研究非常有限。细胞内90%的代谢发生在线粒体，即线粒体功能是决定细胞命运及协调细胞代谢、免疫力、应激反应和细胞凋亡的关键，已有研究证实机体内许多细胞特异性应激反应在响应线粒体功能障碍（Chapinal et al.，2011；Sordilloand Raphael，2013；Denis-Robichaud and Dubuc，2015；Moseti et al.，2016；Suomalainen and Battersby，2017），如胰岛素抵抗（高文文等，2016）、内源性线粒体介导的细胞凋亡（徐薇等，2021）及细胞炎症反应（唐燕，2022）等。但线粒体功能易受营养、活性氧（ROS）、遗传和衰老等因素影响（刘兴梅等，2022），当发生功能紊乱时线粒体形态异常膨大、呼吸链蛋白表达降低、膜电位下降（杨苗等，2023）。骨骼肌线粒体是氧化脂肪酸最重要的细胞器，当骨骼肌细胞线粒体氧化功能下降或线粒体数量减少时，可能会导致进入骨骼肌细胞的游离脂肪酸不能完全被氧化，而引起脂质代谢及其他代谢过程紊乱（Choi etal.，2008）。Ospina等（2010）研究表明，与血液中NEFA和-羟丁酸（-hydroxybutyrate，BHBA）浓度正常的奶牛相比，产后经历能量负平衡状态的奶牛患皱胃异位、高酮血症、子宫内膜炎及胰岛素抵抗等疾病的风险更高。董记红等（2017）研究证实，NEFA能诱导体外培养的奶牛肝细胞发生氧化还原失衡。Song等（2021）研究发现，当奶牛血浆中NEFA浓度升高，其乳腺上皮细胞的ROS含量增加，抗氧化酶活性及线粒体膜电位下降，即奶牛乳腺上皮细胞处于氧化应激状态，线粒体功能受损。此外，高脂饮食等营养因素会促使血清NEFA水平升高，导致人类或动物的肝脏和骨关节（Medina-Luna et al.，2017）、胰腺（Honget al.，2020）等多种组织发生氧化应激损伤。在肌细胞上，Ming等（2013）研究表明，以0.75 mmol/L棕榈酸酯和2%牛血清白蛋白处理C2C12细胞24 h，可损害线粒体功能并导致体外胰岛素抵抗。本课题组前expression of genes related to mitochondrial function and lipid metabolism was detected by real-time fluorescent quantita-tive PCR.【Result】Considering the effect of NEFA on survival rate and morphology of bovine skeletal muscle cells，1.5mmol/L NEFAstimulation for 2 h was selected as the optimal dose-time combination for subsequent experiments.After 2 hstimulation with 1.5 mmol/L NEFA，the mitochondrial volume of bovine skeletal muscle cells became smaller，the matrixcolor was deepened，the mitochondrial ridge arrangement was disordered，and tended to be fused，even some of themwere vacuolar.The number of cells with decreased mitochondrial membrane potential was greatly increased by 38.08%compared with the control group（stimulation 0 h）（P0.05，the same below）.Compared with the control group（stimula-tion 0 h），the content of MDA in the supernatant of cell culture was significantly increased by 1.38 times，while the intra-cellular CAT activity was extremely significantly decreased by 60.63%（P0.01，the same below），and the activity ofSOD was significantly decreased by 34.21%.Real-time fluorescent quantitative PCR detection results showed that after 2 hstimulation with 1.5 mmol/L NEFA，the relative expression levels of NRF1 and PGC-1 genes regulating mitochondrialgene replication and transcription，MFN2 gene regulating mitochondrial fusion，mitochondrial respiratory chain keyenzyme genes（except COV gene），Patatin-like phospholipase domain 2 protein gene（PNPLA2）and long chain lipoic acidextension enzyme 6 gene（ELOVL6）were extremely significantly decreased，the relative expression of carnitine lipoacyl-transferase 1B gene（CPT1B）was extremely significantly increased.【Conclusion】High concentration of NEFA has lipidtoxicity on bovine skeletal muscle cells，affecting mitochondrial morphology，function and membrane potential，causingmitochondrial dysfunction and abnormal cellular fatty acid metabolism，resulting in oxidative stress，and inducing abnor-mal lipid deposition.Key words：bovine；perinatal period；non-esterified fatty acids（NEFA）；skeletal muscle cells；mitochondrial func-tion；metabolic abnormalityFoundation items：National Natural Science Foundation of China（32002205）；Key Project of Guizhou Scienceand Technology Foundation（QKHJC20201Z028）；Project of State Key Laboratory of Animal Nutrition（2004DA125184F1902）7期2117期研究证实，在高NEFA浓度下骨骼肌会提高对NEFA的摄取率，但不能完全氧化利用（Yang et al.，2018）。可见，NEFA与线粒体功能密切相关。【本研究切入点】至今，有关高NEFA胁迫对奶牛骨骼肌线粒体功能形态及其代谢过程影响的研究较少，在骨骼肌细胞上也尚未建立高NEFA胁迫模型。【拟解决的关键问题】以牛骨骼肌细胞为研究对象，通过最佳浓度时间组合刺激后利用透射电镜、流式细胞术及实时荧光定量PCR等探析高NEFA胁迫下骨骼肌细胞的受损情况，并结合脂滴染色检测脂肪酸与糖代谢关键元件的表达丰度变化，明确NEFA胁迫对牛骨骼肌细胞线粒体及代谢过程的影响，为揭示围产期奶牛营养代谢病的作用机理提供参考依据。1材料与方法1.1试验材料牛骨骼肌细胞由高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室提供。软脂酸、棕榈油酸、硬脂酸和油酸购自上海麦克林生化科技股份有限公司；亚油酸购自上海源叶生物科技有限公司；丙二醛（MDA）含量检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，油红O染色液（细胞专用）、RNase-Free Water和JC-1染色试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；TRIzol、PowerUPTMSYBRTMGreen Master Mix和Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；CCK-8试剂盒、胎牛血清及DMEM/F-12（1 1）培养基购自美国Glpbio公司。1.2NEFA刺激对细胞存活率和形态的影响将冻存的原代牛骨骼肌细胞解冻后接种至细胞培养瓶，加入5.0 mL含10%胎牛血清和1%双抗（青霉素+链霉素）的高糖培养基，置于37、5%CO2的细胞培养箱中培养至细胞铺满瓶壁的85%90%，吸取培养液并以无菌PBS润洗3次，加入0.25%胰蛋白酶，在细胞培养箱中静置消化5 min，待细胞变圆脱落后加入含10%胎牛血清和1%双抗的培养基终止消化，制成细胞悬液。将细胞悬液接种至96孔细胞板中，密度为2104个/孔，边缘孔加入等体积的PBS，置于细胞培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后弃除培养基，加入PBS润洗3次，随后加入含2%BSA和1%双抗的饥饿培养基对细胞进行12 h的饥饿处理。饥饿处理结束后吸出原培养基，以37 预热且NEFA终浓度为0.6、1.2、1.5和1.8 mmol/L的完全培养基分别培养0和2 h。每处理组均设3个重复，培养结束后置于电子显微镜下观察拍照。随后，每孔加入含10%CCK-8的培养基，在37 细胞培养箱中避光孵育2 h。孵育结束后放入酶标仪，在450 nm波长处测定各孔吸光值，记录数据，并计算细胞存活率：存活率（%）=（As-Ab）/（Ac-Ab）100式中，As为试验孔（含细胞、培养基、CCK-8溶液和NEFA）吸光值，Ac为对照孔（含细胞、培养基和CCK-8溶液，不含NEFA）吸光值，Ab为空白孔（含培养基和CCK-8溶液，不含细胞和NEFA）吸光值。确认最佳刺激浓度后重新铺板，并以37 预热且含最佳刺激浓度NEFA的饥饿培养基培养细胞0、1、2、4、6和12 h。培养结束后按上述方法加入CCK-8孵育2 h，测定吸光值并计算细胞存活率。1.3NEFA对细胞线粒体超微结构的影响将细胞悬液接种至6孔细胞板中，待细胞生长汇合度达85%90%时，按1.2的方法对细胞进行饥饿处理，饥饿处理结束后加入含1.5 mmol/L NEFA的刺激培养基进行培养，刺激培养2 h，用PBS润洗3次。用细胞刮收集细胞并转移至无菌的1.5 mL尖底离心管中，加入1.0 mL的4 电镜固定液，吹散后再垂直静置（自然沉降）1 h，轻轻吸取上清液，再加入1.0 mL新预冷的2.5%戊二醛，置于4 冰箱固定。随后以1%四氧化锇再固定，经脱水、渗透、包埋、切片及染色后置于透射电镜下采集图片，观察细胞的具体形态变化。1.4NEFA对细胞脂质沉积的影响将细胞悬液以1106个/孔的密度接种至6孔细胞板中，培养24 h待细胞贴壁后饥饿处理12 h，以PBS润洗3次，设NEFA刺激组和对照组。NEFA刺激组加入含NEFA（终浓度1.5 mmol/L）的刺激培养基培养2 h，对照组以含NEFA（终浓度1.5 mmol/L）的刺激培养基培养0 h，处理结束后以PBS润洗3次，吸尽PBS，按照说明对骨骼肌细胞进行染色。（1）油红O染色：加入1.0 mL ORO Fixative固定20 min；弃固定液，蒸馏水润洗2次，缓慢加入60%异丙醇（用超纯水制备）浸润细胞表面，静置5 min；加入新配制好的ORO Stain浸染细胞15 min，染色结束后以蒸馏水润洗56次，直至无多余染液；待样品干燥后置于显微镜下观察。（2）BODIPY 493/503染色：用PBS稀释BODIPY493/503储存液，使其终浓度为2.0 mmol/L；加入BODIPY 493/503工作液，置于细胞培养箱中继续避光孵育；孵育期间每隔5 min轻轻晃动6孔细胞板；染色结束后以蒸馏水润洗56次，直至无多余染液，置于荧光显微镜下用蓝光激发，观察并拍照。黄泳等：NEFA对牛骨骼肌细胞线粒体功能及脂肪酸代谢相关基因的影响54卷南 方 农 业 学 报 21181.5NEFA对细胞线粒体膜电位的影响1.5.1流式细胞术检测细胞线粒体膜电位变化将细胞悬液以2106个/孔的密度接种于6孔细胞板中，置于37、5%CO2培养箱中培养，待细胞生长汇合度达90%时更换饥饿培养基继续培养12 h。饥饿处理结束后按1.4的方法进行分组，NEFA刺激结束后以0.25%胰蛋白酶消化细胞，1000 r/min离心3 min，收集细胞，加入无Ca2+和Mg2+的PBS漂洗2次，调整细胞悬液浓度至106个/mL。按照试剂盒说明避光孵育后，以JC-1染色缓冲液洗涤2次，清洗掉未结合的染料，再加入染色缓冲液重悬细胞，流式细胞术检测荧光强度。1.5.2荧光显微镜观察线粒体膜电位变化将无菌细胞爬片置于6孔细胞板中，再接种细胞悬液（1106个/孔），置于细胞培养箱培养24 h，待细胞贴壁后进行饥饿处理及NEFA刺激。刺激结束后以PBS清洗细胞爬片，加入JC-1染液充分混匀，37 孵育20 min。孵育结束后以JC-1染色缓冲液洗涤2次，加入细胞培养液，置于荧光显微镜下观察红/绿荧光强弱情况。1.6NEFA对细胞抗氧化功能的影响取经饥饿处理及NEFA刺激后的牛骨骼肌细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并收集细胞，以PBS调节细胞密度，1000 r/min离心3 min，收集细胞，加入裂解液，冰浴条件下超声波裂解。取上清液，按照试剂盒说明分别检测细胞内的过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，以及培养上清液的MDA含量。1.7实时荧光定量PCR检测线粒体功能及脂质代谢相关基因表达情况以TRIzol法提取对照组和NEFA刺激组的牛骨骼肌细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明反转录合成cDNA。运用实时荧光定量PCR检测各组细胞样品中核呼吸因子（NRF1）、过氧化物酶体增殖活化受体辅激活因子1（PGC-1）、线粒体融合蛋白-2基因（MFN2）、线粒体呼吸链关键酶基因（COI、SQR、QCR、COX和COV）、含Patatin样磷脂酶域2蛋白基因（PNPLA2）等相关基因的表达情况，以-actin为内参基因，采用2-Ct法计算目的基因的相对表达量。实时荧光定量PCR扩增引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及参数见表1。1.8统计分析试验数据以Excel 2016进行统计，采用SPSS18.0进行差异显著性分析。多组间数据比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），而两组间数据比较采用独立样本t检验。基因GenePGC-1NRF1MFN2COISQRQCRCOXCOVCPT1BPNPLA2ELOVL1ELOVL6-actin登录号Accession numberAH013919.2NM_001098002.2NM_001190269.1KJ920209.1XR_003031167.1XM_027526687.1XM_027566570XM_027542252.1NM_001034349.2NM_001046005.2NM_001034703.2NM_001102155.1AY141970.1引物序列Primer sequenceF：5-GTCATGCCTCATCCTCTGCT-3R：5-TGAACTCGGTTTGGGACTAA-3F：5-GCAAGCCATTGTCCTTTGTATCTC-3R：5-TCTTCCAGGATCATGCTCTTGTAC-3F：5-CCGTGGTCCTCAAGGTTTACAAG-3R：5-GTTTCAAGCCGTCAATCATCTCC-3F：5-AGGATGCGAGGAGTAGTAGGA-3R：5-GAGGGTTCGGTAACTGACTTG-3F：5-CAGAACCTGATGCTTTGTGC-3R：5-ACTCGTCAACCCTCTCCTTG-3F：5-TCTCATTTGCTTCGTCTTGC-3R：5-TCTGGTGCTGTGGTGACATT-3F：5-ATCTCGGGTTTTTGGGTTGC-3R：5-CGGGTTTCTCCTCTCCGTGG-3F：5-TCCAGCCTGCCAGAGACTAT-3R：5-TGCACCTCCAGGGCATTTAG-3F：5-TGCTACAACAGGTGGTTCGACAAG-3R：5-GCCCAGGACAAACTCCCAGAGG-3F：5-GCTGAAGATTCTGCCTGCTGATTGCT-3R：5-AAGCTCCTCTTTGGAGTTGAAGTGGG-3F：5-ATGTACGGCACCATCTTCTTCG-3R：5-CATGTTTCTCAGTTGGCCTTGAC-3F：5-GCTCTTCTGCCACTTCTTCTT-3R：5-ATGTGATTCCTTGTGCCATT-3F：5-GTCCACCTTCCAGCAGAT-3R：5-GCTAACAGTCCGCCTAGAA-3扩增产物长度（bp）Amplication product size10211414112010619718814812912113915190退火温度（）Annealing temperature53.953.953.958585858586059606060表 1实时荧光定量PCR扩增引物序列信息Table 1Real-time fluorescence quantitative PCR amplified primer sequence information7期21192结果与分析2.1NEFA对牛骨骼肌细胞存活率的影响分别以0.6、1.2、1.5和1.8 mmol/L的NEFA刺激牛骨骼肌细胞0和2 h，结果如图1-A所示。与对照组（刺激0 h）相比，1.2和1.5 mmol/L NEFA刺激组的细胞活率分别极显著上升7.70%和7.91%（P0.05，下同）。为进一步确定1.5 mmol/L NEFA对细胞存活率的影响，以含1.5 mmol/L NEFA的培养基分别刺激牛骨骼肌细胞0、1、2、4、6和12 h，结果如图1-B所示，各试验组的细胞存活率与对照组（刺激0 h）相比均无显著差异，表明1.5 mmol/L NEFA对牛骨骼肌细胞无细胞毒性，可用于后续研究。2.2NEFA对牛骨骼肌细胞形态的影响添加不同浓度（0、0.6、1.2、1.5和1.8 mmol/L）NEFA刺激牛骨骼肌细胞2 h后，在显微镜下观察细胞形态的变化。与空白对照组（图2-A）相比，经0.6 mmol/LNEFA刺激的细胞形态无明显变化（图2-B）；1.2mmol/L NEFA刺激引起部分细胞的胞质浓缩（图2-C）；经1.5 mmol/L NEFA刺激后大部分细胞变圆，胞内出现大量圆形透明脂滴，细胞仍能贴壁生长（图2-D）；1.8 mmol/L NEFA刺激牛骨骼肌细胞2 h后，细胞失去贴壁能力，呈现大批量死亡（图2-E）。2.3NEFA对牛骨骼肌细胞线粒体超微结构的影响由图3可知，在1.5 mmol/L NEFA刺激前，牛骨图 1NEFA刺激对牛骨骼肌细胞存活力的影响Fig.1Effects of NEFAstimulation on the viability of bovine skeletal muscle cells*表示差异极显著（P0.01）*indicated extremely significant effect（P0.01）细胞活率（%）Cell viability12011010090500120110100908070细胞活率（%）Cell viability0 h2 h0.61.21.51.80124612AB图 2NEFA刺激浓度对牛骨骼肌细胞形态的影响Fig.2Effects of NEFAstimulation concentration on the morphology of bovine skeletal muscle cellsA：0 mmol/L；B：0.6 mmol/L；C：1.2 mmol/L；D：1.5 mmol/L；E：1.8 mmol/LBCDEANEFA刺激浓度（mmol/L）NEFAstimulation concentrationNEFA刺激时间（h）NEFAstimulation time*黄泳等：NEFA对牛骨骼肌细胞线粒体功能及脂肪酸代谢相关基因的影响54卷南 方 农 业 学 报 2120骼肌细胞线粒体的形态多呈长椭圆形（图3-A和图3-B，红色箭头），结构完整，排列紧密；基质颜色较浅但数量较多，线粒体嵴排列整齐，并未出现紊乱、肿胀及断裂等现象，提示此时的线粒体结构稳定。经1.5 mmol/L NEFA刺激2 h后，牛骨骼肌细胞线粒体出现不同程度的结构缺失（图3-C和图3-D，蓝色箭头），排列稀疏松散；大部分线粒体体积变小，基质颜色变深；线粒体嵴排列紊乱，且趋向于融合现象，甚至部分呈空泡状。2.4NEFA对牛骨骼肌细胞脂质沉积的影响为探究NEFA对牛骨骼肌细胞脂质沉积的影响，分别采用油红O和BODIPY 493/503荧光染料对细胞内脂滴进行染色，结果（图4）显示，经1.5 mmol/LNEFA刺激2 h后，牛骨骼肌细胞内出现较多红色且围绕在细胞核周围的细小脂滴（图4-A和图4-B）；此外，细胞内发出绿色荧光的脂滴数量明显增多，荧光强度明显增强（图4-C和图4-D）。2.5NEFA对牛骨骼肌细胞线粒体膜电位的影响在膜电位较高的线粒体内，JC-1在线粒体内膜侧积聚形成JC-1聚合物，呈现红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1无法聚集在线粒体基质中，此时JC-1为单体，则呈现绿色荧光（Reers et al.，1995）。图 3牛骨骼肌细胞透射电镜扫描结果Fig.3Results of bovine skeletal muscle cells transmission electron microscope scanning图 4牛骨骼肌细胞内脂滴染色结果Fig.4Staining results of lipid droplets in bovine skeletal muscle cells0 h2 h5.012.00 h2 h油红O染色Oil red O stainingBODIPY 493/503染色BODIPY 493/503 staining7期2121由图5-A可看出，未经1.5 mmol/L NEFA刺激的牛骨骼肌细胞显示线粒体极化良好，呈现红色荧光；经1.5 mmol/L NEFA刺激2 h后，细胞中的红色荧光数量减少、荧光强度减弱，而绿色荧光数量明显增多且荧光强度明显增强。流式细胞术检测结果（图5-B和图5-C）显示，经1.5 mmol/L NEFA刺激2 h后，线粒体膜电位下降的牛骨骼肌细胞数量明显增多，较对照组（未经NEFA刺激）显著提高38.08%（P0.05，下同）。2.6NEFA对牛骨骼肌细胞抗氧化功能的影响由表2可知，经1.5 mmol/L NEFA刺激2 h后，牛骨骼肌细胞内的CAT和SOD活性较对照组（刺激0 h）均有不同程度的降低趋势，其中，CAT活性极显著降低60.63%，SOD活性显著降低34.21%。在MDA含量方面，经1.5 mmol/L NEFA刺激2 h的牛骨骼肌细胞培养上清液MDA含量为3.180.13 nmol/mL，较对照组（刺激0 h）显著提高1.38倍。2.7NEFA对线粒体功能及代谢相关基因的影响由图6可看出，经1.5 mmol/L NEFA刺激2 h后，牛骨骼肌细胞中调控线粒体基因复制与转录的NRF1和PGC-1基因相对表达量较对照组（刺激0 h）极显著降低，分别降低67.94%和96.44%；调控线粒体融合的MFN2基因相对表达量较对照组（刺激0 h）极显著降低60.53%。此外，线粒体有氧代谢相关基因COI、SQR、QCR和COX相对表达量极显著降低，COV基因相对表达量变化差异不显著；葡萄糖转运关键酶基因GLUT4和长链脂酸延伸酶1基因（ELOVL1）相对表达量变化差异也不显著；肉毒碱脂酰转移酶1B基因（CPT1B）相对表达量极显著提高；而PNPLA2和长链脂酸延伸酶6基因（ELOVL6）相对表达量极显著下降。3讨论围产期处于能量负平衡状态的奶牛机体通过启动体脂动员，大量NEFA进入血液为机体供能，但NEFA浓度过高极易导致高NEFA血症（Ingvartsen，2006；Gonzlez et al.，2011），并诱发炎症及脂肪肝等代谢疾病。高浓度的NEFA对奶牛肝脏及其他组织具有明显脂毒性，能诱导机体产生氧化应激，同时导致奶牛肝细胞和乳腺细胞等出现线粒体功能障碍（Swartz et al.，2021），现有的研究主要集中在肝脏及外周血响应体脂动员（Bobe et al.，2004）。骨骼肌作为奶牛机体最大的组织，但其在围产期代谢过程中扮演的角色及高NEFA胁迫下所受的影响尚未明确。因此，亟待建立牛骨骼肌细胞NEFA暴露模型，探究高浓度NEFA是否致使骨骼肌细胞产生氧化应激及线粒体功能障碍。线粒体形态结构及膜电位稳定对维持细胞的正常生理功能至关重要（Bhatti et al.，2016；Bulthuiset al.，2018）。线粒体膜电位下降意味着细胞发生凋图 5牛骨骼肌细胞JC-1染色及流式细胞术检测结果Fig.5JC-1 staining and flow cytometry results of bovine skele-tal muscle cellsA：JC-1染色镜检结果；B：流式细胞术检测散点图；C：流式细胞术检测线粒体膜电位结果*表示差异显著（P0.05）A：Picture of JC-1 staining；B：Flow cytometry scatter plot；C：Result of mitochondrial membrane potential by flow cytometry*indicated significantdifference（P0.05）02线粒体膜电位下降率（%）Decrease in mitochondrialmembrane potential50.040.030.020.010.00.0C*NEFA刺激时间（h）NEFAstimulation timePE-A105104103102102103104105FITC-ABPE-A105104103102102103104105FITC-AJC-1聚合物JC-1 polymerJC-1单体JC-1monomerMergeA0 h2 h黄泳等：NEFA对牛骨骼肌细胞线粒体功能及脂肪酸代谢相关基因的影响54卷南 方 农 业 学 报 2122亡或线粒体功能发生障碍（Hisatomi et al.，2009）。作为氧化等一系列脂质代谢的主要场所，线粒体的结构与功能极易在围产期受高浓度NEFA脂毒性的影响（高文文等，2016；Sunny et al.，2017）。本研究结果表明，经1.5 mmol/L NEFA刺激2 h后，牛骨骼肌细胞线粒体发生体积减小、固缩等形态变化，线粒体膜电位下降的细胞数量明显增多。线粒体脂质代谢异常可导致MDA含量上升，而引起线粒体膜的流动性降低、线粒体膜电位下降及通透性增加，最终导致线粒体氧化损伤（刘井波和彭双清，2005；代少华，2018）。在本研究中，经1.5 mmol/L NEFA刺激2 h的牛骨骼肌细胞培养上清液MDA含量为3.180.13nmol/mL，较对照组（刺激0 h）显著提高1.38倍，而细胞内的CAT活性极显著降低60.63%，SOD活性显著降低34.21%。此外，PGC-1、NRF1和MFN2基因表达下调与MD