植物叶绿体DNA的提取.doc

实验1 植物叶绿体DNA的提取、PCR扩增与电泳观察
【实验目的】
1、学习从新鲜的绿色叶片中提取叶绿体DNA的方法
2、学习和掌握琼脂糖凝胶电泳观察DNA的操作方法
3、学习和掌握PCR实验的原理和操作方法
【实验原理】
叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，具有相对独立的遗传物质——叶绿体基因组DNA（ctDNA），大小在120～160 kb，其DNA分子都是以共价、闭合、环状双链形式存在。由于cpDNA相对保守及其重要功能，已被广泛用于细胞质遗传、植物的系统发育、遗传多样性和亲缘关系等多方面的研究，而获得纯度高、产量好的、结构完整的ctDNA是开展相关研究的前提条件。然而ctDNA的提取是限制深入研究的重要因素，传统的提取方法包括梯度离心提取ctDNA的方法，对设备要求高，成本高，耗时长．产率低。因此，我们要尽可能快速、简便地获得质纯、量大的ctDNA．一般来说获得纯度高、浓度大的叶绿体DNA很难，主要是因为叶绿体DNA含量太少同时在提取中有诸多因素干扰(如：核DNA、RNA、蛋白质等)。本实验通过改进部分传统操作，提取叶绿体基因组DNA，同时利用琼脂糖凝胶电泳及PCR实验检验提取效果。
【实验仪器与试剂】
1、 器材：
剪刀、烧杯、移液器、枪头、量筒、匀浆器、纱布、300目尼龙网、注射器、离心管、滤膜
2、试剂：
① 酶液：1%纤维素酶、0.6mM蔗糖、8mM CaCl2·2H2O、10mM NaH2PO4·2H2O，pH5.6
② 洗涤液：0.6mM蔗糖、8mM CaCl2·2H2O、2mM NaH2PO4·2H2O，pH5.6
③ 10%SDS
④ 溶液A：25mM EDTA，50mM Tris，pH=8.0
⑤ Tris饱和酚，氯仿，异丙醇，TE，琼脂糖，gold view，Loading buffer，DNA marker
⑥ 新鲜叶片
⑦ PCR Buffer、Mg2+、dNTP、上、下游引物、ddH2O、Taq DNA聚合酶
【实验步骤】
一、 叶片采集
采集适量新鲜绿叶（约10g）
二、 细胞破碎
首先利用剪刀将叶片剪碎，然后放于匀浆器中，先加入不含酶的酶液进行匀浆，弃渣，将液体转移至烧杯中，加入纤维素酶至终浓度为1%后搅拌均匀，50度水浴约30分钟。
三、 叶绿体分离
将经酶液处理的液体取出，依次用纱布和300目尼龙网与大注射器过滤，取滤液。
1、 用电组：将上述滤液转移至50mL离心管中，3000rpm离心3分钟，弃上清。用10mL洗涤液重悬洗涤后3000rpm离心3分钟，弃上清，洗涤两次后，即分离得到叶绿体。
2、 不用电组：利用大注射器及0.2μm滤膜过滤上述滤液后，将滤膜上的叶绿体刮下，转移至1.5mL离心管中，即分离得到叶绿体。
四、 DNA提取
1、用电组：
① 向叶绿体中加入500μL溶液A把叶绿体悬浮，转移至1.5mL离心管中。
② 加入200μL10%SDS（裂解叶绿体膜，释放DNA），混匀后静置2min；
③ 加入350μL苯酚（使蛋白质变性）+350μL氯仿（与苯酚互溶，易于除去苯酚），混匀，10000rpm离心2min；
④ 转移上层液体至新的离心管中，加入等体积氯仿（去除苯酚），混匀，10000rpm离心2min；
⑤ 转移上层液体至新的离心管中，加入0.6倍体积异丙醇（沉淀DNA）沉淀10min；
⑥ 10000rpm离心5min，弃上清；
⑦ 加入500μL70%乙醇（去除盐离子）洗涤沉淀，10000rpm离心5min，晾干；
⑧ 30μL TE溶解DNA；
2、 不用电组：
① 向叶绿体中加入500μL溶液A把叶绿体悬浮；
② 加入200μL10%SDS，混匀后静置2min；
③ 加入适量KI固体至饱和后静置至出现明显分层；
④ 将下层透明液体转移至DNA吸附柱中，用洗耳球将液体吹出，DNA吸附于硅胶膜上，弃液体；
⑤ 向吸附柱中加入500μL70%乙醇，用洗耳球吹出，弃液体，晾干；
⑥ 将吸附柱至于新的1.5mL离心管中，用30μL TE溶解DNA，用洗耳球将液体吹入离心管中。
五、 PCR扩增特征条带
25μL体系：
PCR Buffer 2.5μL
Mg2+ 1.5μL
dNTP 2.0μL
上、下游引物 各2.5μL 加至PCR管中
ddH2O 8.0μL
Taq DNA聚合酶 1.0μL
DNA模板 5.0μL
PCR结束后，取5 μL在 O．8％的琼脂糖上电泳，观察。
六、 叶绿体DNA的电泳观察
取提取的叶绿体DNA 5 μL在 O．8％的琼脂糖上电泳，电泳1h后，使用自制的LED灯进行观察。

【实验结果与讨论】
1、为保证叶绿体DNA的含量和纯度，在本实验操作中，样品前处理、抽提、纯化等操作中应注意什么？
2、提取不同种植物的叶绿体DNA，比较、分析实验结果。