补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓的修复作用及其机制研究.pdf

归闪华，罗昊翔 总黄酮类化合物基于 信号通路抗肝纤维化的研究进展 右江民族医学院学报，（）：苑致维，张尔馨，郑沁薇，等 青黛对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织 信号通路相关因子表达的影响中国中医药信息杂志，（）：刘巧玲 基于 信号通路调控自噬探讨养阴生肌散抑制克罗恩病肠道纤维化的机制研究 南京：南京中医药大学，fi ，（）：，fi ff fi ，（）：，（）：补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓的修复作用及其机制研究翁家贤，梁超伦，肖方骏，杨海梅，曾秀云，梁家畅，王 凯，邓健平，文雅倩，王 文，罗 丹，李 兴，（广州中医药大学中药学院，广东 广州；广州中医药大学，广东 广州；广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州；广州中医药大学第二附属医院，广东 广州）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金青年项目（）；广东省中医院拔尖人才科研专项资助（）；广东省中医药管理局（）；广州市科技计划项目基础研究计划（）作者简介：翁家贤（），女，博士生，研究方向为中药药理与新药研发。：，：通信作者：李兴（），男，博士，副研究员，研究方向为骨科基础与临床研究。：，：摘要：目的 探讨补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓的修复作用及其机制。方法 将大鼠随机分为假手术组、模型组和补肾活血方低、高剂量组（、）。采用 法制备脊髓损伤大鼠，造模第 天给药组灌胃给予相应剂量药液，假手术组和模型组灌胃给予纯水，连续 。于术后不同时间点观察大鼠后肢运动功能并进行 评分，并在术后第、天进行大鼠足印实验；术后第 天使用相应试剂盒检测脊髓组织 活性与 水平，法检测脊髓组织、蛋白表达；术后第 天采用 染色和 染色观察脊髓组织的变化，采用免疫荧光染色检测、的表达。结果 与模型组比较，补肾活血方高剂量组大鼠后肢功能、脊髓组织形态学均有改善（），脊髓组织 活性、荧光强度和、蛋白表达升高（），水平、荧光强度和 蛋白表达降低（）。结论补肾活血方可以有效减轻脊髓损伤大鼠早期的脊髓损伤，其机制一方面可能是通过抑制 信号通路抑制脊髓组织氧化应激反应，减少神经细胞凋亡；另一方面通过抑制星形胶质细胞的活性，解除胶质瘢痕引发的屏障，提高神经再生能力，使脊髓组织的修复能力增加。关键词：补肾活血方；脊髓损伤；氧化应激；凋亡；信号通路中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，年 月第 卷 第 期中 成 药 （，；，；，；，）：，（）（），；，；，（），（），（），：；脊髓损伤是一种由事故、创伤、运动损伤、结核、肿瘤等直接或间接因素引起的重大神经性疾病，通常表现为肢体的感觉与运动出现障碍、反射消失、二便失常等，全球每年有 万至 万人 受 其 影 响，具 有 高 致 残 率、高 死 亡 率 等特点。研究发现脊髓损伤的致残更多来源于脊髓原发性损伤后的继发性损伤，因此脊髓损伤早期处理的关键在于尽量减轻继发性损伤，包括手术减压改善脊髓血液灌注、药物保护神经等。过去认为使用大量糖皮质激素的冲击疗法能促进脊髓的恢复，然而近年来研究发现该疗法的副作用较大，因此建议谨慎使用。中医药在脊髓损伤早期的治疗中拥有巨大潜力，前期研究发现补肾活血方对改善脊髓压迫引起的损伤有较明显的治疗效果，且副作用极小，然而机制未明。因此本研究将进一步探讨补肾活血方对脊髓损伤早期大鼠模型的干预作用与机制。材料 动物 只 级 雄性大鼠，体质量，购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号 （粤），饲养于广州中医药大学 动物实验中心，实验动物使用许可证号 （粤），自由摄水饮食，昼夜节律为 ，环境温度（），相对湿度 ，适应性喂养 周后开始实验，实验动物伦理审查号。药物 补肾活血方每剂含巴戟天 、丹参、仙茅 、熟附子 、虎杖 、牛黄 、熊胆 ，由广州中医药大学第二附属医院提供。试剂与仪器超氧化物歧化酶（，）活 性 检 测 试 剂 盒、丙 二 醛（，）含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号、）；、抗体（美国 公 年 月第 卷 第 期中 成 药 司，货号、）；、抗体（英国 公司，货号、）；抗体（武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司，货 号）；抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号）；抗体（美国 公司，货号）。倒置荧光显微镜（日本 公司）；型实时荧光定量 仪（美国 公司）；高速冷冻离心机（美国 公司）。方法 造模 法制备脊髓损伤大鼠。大鼠腹腔注射 戊巴比妥钠（）致其全身麻醉后固定，剃除背部皮毛，以 节段脊髓为中心做约 切口，显露 节棘突，截去棘突和椎板，使脊髓组织完全显露。使用 精密脊髓损伤撞击器（型号）设置具体参数（打击速度 ；打击深度 ；停置时间 ），击打 脊髓，观察到被击打部分迅速充血，颜色变深红或红紫色，同时大鼠尾部、后肢出现一过性的痉挛抽搐，脊髓表面覆盖一层自体脂肪以减少粘连。随后止血并且缝合伤口，碘伏擦拭缝合处皮肤。假手术组按照以上方式只暴露脊髓组织不进行打击。分组与给药大鼠随机分成假手术组、模型组和补肾活血方低、高剂量组，每组 只。按照人与大鼠给药剂量换算，低、高剂量为、（相当于人临床剂量的、倍）。造模成功的次日开始给药，给药组大鼠灌胃给予相应剂量药物，每天 次，每 间歇 ，每只大鼠每次灌胃，假手术组和模型组灌胃给予等体积纯水，连续干预。运动功能评分采用（）量表和足印实验评价各组大鼠后肢运动功能恢复情况。术后第、天时将大鼠置于旷场中自由活动，观察时间 ，根据 量表评估大鼠后肢运动能力，总分 分（分代表后肢完全瘫痪；分代表后肢正常运动），分数越高，代表运动功能越好。术后第、天进行大鼠足印实验，记录大鼠后肢运动轨迹。取材 术后第 天取损伤脊髓组织于液氮中保存，用以 实验和 活性、水平检测；术后第 天取损伤脊髓组织经 溶液脱钙、脱水处理后石蜡包埋切片，厚度为 ，用于、染色和免疫荧光染色。染色观察脊髓组织形态取预制好的切片，脱蜡后使用苏木精伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于倒置显微镜下随机选取损伤区域的 个视野，观察组织病理学变化，并采用 分制进行评分，即 分，无损伤；分，灰质可见 个嗜酸性神经元；分，灰质可见 个嗜酸性神经元；分，灰质可见超过 个嗜酸性神经元；分，灰质的梗死面积小于；分，灰质梗死的面积在 和 之间；分，灰质梗死的面积大于。染色观察脊髓组织神经细胞情况预制好的切片置于焦油紫染液中浸染、冲洗后分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于倒置显微镜下随机选取损伤区域的 个视野，观察尼氏小体染色情况，并对包含尼氏小体的神经元计数。两名研究人员使用 软件分别进行独立计数，最终结果取平均值。试剂盒检测各组大鼠脊髓组织 活性和 水平 取适量脊髓组织加双蒸水匀浆，、离心 ，取上清，按试剂盒说明书操作检测 活性和 水平。免疫荧光法检测脊髓组织损伤局部神经细胞及星形胶质细胞标志物水平切片修复后，用 山羊血清孵育，分别加入 （）、（）一抗，孵育过夜，再分别加入荧光二抗，常温孵育，充分漂洗后用含 的抗荧光淬灭封片剂封片；以 山羊血清代替一抗作为阴性对照，于荧光显微镜下观察并拍照。法检测脊髓组织氧化应激通路和细胞凋亡相关蛋白表达 取适量脊髓组织，匀浆后提取脊髓组织总蛋白，法检测蛋白浓度，依次进行电泳、转膜、封闭后分别加入一抗、，内参为 （），孵 育 过 夜，加 入 相 应 二 抗（）孵育，显色、成像后计算蛋白相对表达量。统计学分析通过 软件进行处理，数据以（）表示，两组间比较采用 检验，多组间比较采用单因素方差分析。表示差异有统计学意义。结果 补肾活血方对脊髓损伤大鼠后肢运动功能及脊髓组织形态学的影响足印图（图）显示，假手术组大鼠后肢功能正常；模型组大鼠后肢功能 年 月第 卷 第 期中 成 药 丧失，且术后 仍未能恢复；与模型组比较，补肾活血方各剂量组大鼠后肢功在术后 均有不同程度的恢复，且高剂量组恢复更佳。评分（图）显示，补肾活血方药物干预后，低、高剂量组在术后 评分与模型组几乎一致，而第、天时评分均高于模型组，且高剂量组评分更高，结果表明补肾活血方能恢复脊髓损伤大鼠后肢运动功能。染色（图 ）结果显示，术后第 天时，假手术组大鼠脊髓组织整体构造完好，无明显破坏痕迹，组织间隙与神经细胞的形态、分布均无明显异常；模型组大鼠脊髓组织可见大空洞，并伴随神经细胞形态与分布异常，组织学评分较假手术组升高（）；补肾活血方低剂量组大鼠脊髓组织仍有空洞，但缺损减轻，而补肾活血方高剂量组则仅在部分区域出现小范围空腔，部分区域恢复正常，各剂量组脊髓组织学评分较模型组降低（）。染色（图）结果显示，术后第 天时，假手术组大鼠脊髓组织中可见大量尼氏小体；模型组可见脊髓组织广泛损伤，与假手术组比较尼氏体小体数量减少（）；补肾活血方各剂量组大鼠脊髓组织破坏程度减轻，尼氏体小体数量增加（）。注：与假手术组比较，；与模型组比较，。图 补肾活血方对脊髓损伤大鼠后肢运动功能及脊髓组织形态学的影响（，）（，）补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓组织 活性及 水平的影响 术后第 天，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织 活性降低（），水平升高（）；与模型组比较，补肾活血方各剂量组大鼠脊髓组织 活性升高（），水平降低（），见图。补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓组织、年 月第 卷 第 期中 成 药 注：与假手术组比较，；与模型组比较，。图 补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓组织 活性及 水平的影响（，）（，）、蛋白表达的影响 术后第 天，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织、蛋 白 表 达 降 低（），蛋白表达升高（）；与模 型组比较，补肾活血方各剂量组大鼠脊髓组织、蛋白表达升高（），高剂量组 蛋白表达降低（），见图。注：与假手术组比较，；与模型组比较，。图 补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓组织、蛋白表达的影响（，），（，）补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓组织、荧光表达的影响术后第 天，与假手术组比较，模型组 几乎不表达，荧光强度减弱（），而 大量表达，荧光强度增强（）；与模型组比较，补肾活血方各剂量组 荧光强度增强（），荧光强度减弱（），见图。年 月第 卷 第 期中 成 药 注：与假手术组比较，；与模型组比较，。图 补肾活血方对脊髓损伤大鼠脊髓组织、荧光表达的影响（，）（，）讨论脊髓损伤早期的损害是一个渐进的过程，脊髓受损后，继发性损伤将持续进行数周到数月，因此，干预继发性损伤将直接影响疾病的预后。中医将脊髓损伤早期称为“体堕”，并认为瘀血是其引发功能障碍的原因之一，“督络说”认为脊髓属“髓”，与督脉、肾相关，脊髓疾病可从肾论治。此时督脉受损，髓海不足，加之瘀血阻滞气机，日久则肾虚。因此，治疗脊髓损伤早期当补肾活血。补肾活血方以广东省名老中医邓晋丰教授经验方“肾骨安”的巴戟天、熟附子、仙茅、丹参为基础，再加入虎杖、牛黄与熊胆以增强补肾之力。动物研究表明补肾活血方能有效改善脊髓组织的血供。药理学研究表明，补肾活血方中多味中药具有抗氧化及抗细胞凋亡的作用，推测补肾活血方治疗脊髓损伤的机制可能与其抗氧化、抗细胞凋亡有关。氧化应激是一种氧化与抗氧化失衡引起的病理反应。由于脊髓伤区的抗氧化能力较弱，其中的神经细胞易受到氧化而发生凋亡、退变等。和 是评估氧化应激的重要指标。本研究显示，脊髓损伤发生后 活性降低，水平升高，表明脊髓组织在损伤时出现了氧化应激反应。补肾活血方干预后，脊髓组织 活性升高，水平降低，说明补肾活血方治疗脊髓损伤的作用可能是通过抑制氧化应激反应实现。是一种氧化还原调节因子，在氧化应激条件下能激活、等抗氧化酶基因。补肾活血方中虎杖苷、丹参酮都能激活 信号通路。此外，研究表明补肾活血法可能跟该通路有直接联系。本研究发现，与模型组比较，补肾活血方干预后，大鼠脊髓组织、蛋白表达均升高。因此，补肾活血方抑制氧化应激反应可能与激活 信号通路有关。凋亡是脊髓继发性损伤过程中神经细胞死亡的主要形式。凋亡过程中，家族蛋白是不可忽视的关键。能抑制凋亡，而 能促进凋亡，二者的比值决定了凋亡的进程。本研究显示，补肾活血方能促进 蛋白表达，抑制 蛋白表达，表明其阻止神经细胞的凋亡可能与改变 蛋白比值有关。脊髓损伤后星形胶质细胞产生的胶质瘢痕所形成的屏障则是阻止神经细胞再生的关键机制。本研究显示，损伤发生后脊髓组织中神经细胞几乎消失，而星形胶质细胞明显活跃；补肾活血方干预后神经细胞增多，而星形胶质细胞的表达降低，这说明补肾活血方可能具有减少胶质瘢痕、恢复神经细胞再生能力的作用，这与组织学结果一致。综上所述，补肾活血方可能一方面通过 通路抑制氧化应激反应，减少神经细胞的凋亡；另一方面通过减轻星形胶质细胞产生的瘢痕，恢复神经细胞再生能力，最终实现治疗脊髓损伤的效果。参考文献：，（）：，年 月第 卷 第 期中 成 药 （），（）：邓 欣，周慧宇，双卫兵 急性脊髓损伤急性期后支持治疗的现状与进展 中国医学工程，（）：，：，（）：葛鸿庆，林定坤，陈文治，等 补肾活血方对脊髓型颈椎病动物模型 及其 表达的影响 新中医，（）：，（）：，：，：，（）：贺 丰，穆晓红，付玲玲，等 脊髓损伤的中医研究现状 世界中西医结合杂志，（）：王殿华，陈金亮 关于构建肾督、络脉理论假说论治脊髓病的思考 中医杂志，（）：，：，：，：，：郝 红，李 方，王 志，等 隐丹参酮对脑缺血再灌注损伤神经元细胞凋亡的作用 中国临床药理学杂志，（）：黄俊源，罗志锋，苏 艺，等 发酵巴戟天中多糖、寡糖与蒽醌复配的抗氧化活性研究 食品安全质量检测学报，（）：郑 刚，王想福，张万乾，等 单味中药提取物治疗脊髓损伤的研究进展 中医正骨，（）：，（）：张 焱，郝 剑，李 波，等 氧化应激在脊髓损伤中的研究进展 中华实验外科杂志，（）：，：，：，（）：，：蒋 丽，芮燕君，戴佳琪，等 丹参酮 对过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡和氧化应激的影响 眼科新进展，（）：徐志广，张朴花 虎杖苷通过调控 信号通路减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤 中成药，（）：赵树明，李佳欣，杜艳伟，等 破血化瘀、填精补髓中药汤剂对实验性脑出血大鼠 途径相关蛋白表达的影响 上海中医药杂志，（）：王小磊，郇颜强，贺永雄 脊髓损伤后神经元细胞凋亡的研究进展 内蒙古医学杂志，（）：刘福水，周凡媛，张 义，等 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