NADC34-like PRRSV荧光定量RT-PCR检测方法的建立.pdf

实验研究NADC34-likePRRSV荧光定量RT-PCR检测方法的建立上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第5期曹雪珍1，周庆丰，王连想”，林丽苗”，余新刚”，李薇”，李群辉2*（仲恺农业工程学院动物科技学院，广东广州510 6 40；温氏食品集团股份有限公司广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，广东云浮52 7 40 0；3佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山52 8 2 31）摘要：为了建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的NADC34-like PRRSV我国近年来猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV）主要流行株之一J快速检测方法，针对NADC34-likePRRSV的保守基因ORF5设计并合成特异性引物（F/R）和探针（P），筛选最佳引物、探针浓度组合，建立NADC34-like PRRSV实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionPCR，RT-PCR）检测方法，并对该方法进行方法学分析和临床阳性样品检测验证。结果表明：该方法反应体系中，引物（F/R)和探针（P）的最佳工作浓度分别为0.4umol/L和0.2 mol/L；该方法荧光定量RT-PCR曲线在1.56 10 l1.56X101拷贝/uL范围内呈现良好线性关系，灵敏度可达1.56 X10拷贝/LL高于常规RT-PCR(1.5610拷贝/L)，批内和批间重复实验变异系数均小于0.50%；采用新建立的荧光定量RT-PCR方法检测132 份NADC34-likePRRSV阳性样品，均获得荧光信号曲线。实验结果说明：所建立的NADC34-likePRRSV荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于临床样品NADC34-likePRRSV检测。关键词：猪繁殖与呼吸综合征；病毒变异株；NADC34-like；T a q M a n 探针；实时荧光定量PCR；快速检测猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种传染病，临床上以母猪发热、流产和仔猪呼吸道疾病为特征，在全世界范围内流行1。近年来，多种类型PRRSV变异株的流行，给养猪业带来巨大的经济损失，严重影响各国生猪产业健康发展2-3。PRRSV可分为PRRSV-1基因型（欧洲型）和PRRSV-2基因型（北美型）,2 种基因型的核苷酸相似性只有6 0%左右L4。依据ORF5基因遗传演化,PRRSV-2基因型可进一步分为19系，我国存在其中的1、3、5、8 和9系，1系包括1.11.9共9个亚系5。同美国NADC30毒株基因组结构类似的NADC30-likePRRSV(1.8亚系）毒株，于2 0 12 年在我国首次被发现L6；而同2 0 132 0 15年流行于美国的NADC34毒株7 基因组结构类似的NADC34-like PRRSV(1.5亚系）毒株于2 0 17 年在我国辽宁省被发现并成功分离。随后国内多个省份如黑龙江省、河南省、福建省等相继报道了NADC34-like PRRSV毒株的流行8 。NADC34-likePRRSV毒株的主要特征：NSP2蛋白存在10 0 个氨基酸连续缺失，同时其ORF5基因的限制性片段长度多态性(restriction fragment of length polymorphism,RFLP)属于1-7-4 模式9。NADC34-likePRRSV毒株因其与NADC30-likePRRSV毒株在NSP2缺失模式、病毒早期重组模式上较相似，故存在类似NADC30-like PRRSV大范围流行的可能s。鉴于NADC34-like PRRSV毒株对养猪业的危害性，以及其感染猪康复后可长期带毒且不定期排毒的特点，巫须建立NADC34-like PRRSV毒株快速检测方法，加大监测力度并防控该类毒株在我国的流行。本研究旨在建立一种检测NADC34-like PRRSV毒株的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR方法，为开展NADC34-like PRRSV毒基金项目：“十四五”广东省农业科技创新十大主攻方向“揭榜挂帅”项目（2 0 2 2 SDZG02）作者简介：曹雪珍（1994一），女，硕士，助理实验师，主要从事畜禽疫病分子病原学与防控方面研究。*通信作者，E-mail:7实验研究株临床样品检测及其流行病学调查提供有力的手段。1材料与方法1.1病毒与临床样品NADC34-like PRRSV、NA D C30-l i k e PRRSV、Q YYZ-l i k e PRRSV、H P-l i k e PRRSV、Re s p PRRSVMLV like PRRSV、猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PED V）、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，T G EV）、猪圆环病毒二型（porcine circovirus type 2,PCV2）、猪瘟病毒(classical swine fevervirus，CSFV)和猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV)均由温氏食品集团股份有限公司广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室分离、鉴定、保存。57 6 份疑似PRRSV阳性临床样品（2 2 0 份血清、156 份肺组织、118 份淋巴结、8 2 份扁桃体），于2 0 2 2 年采自全国各生猪养殖场。1.2主要试剂与仪器核酸提取试剂盒（RaPureViralRNA/DNAKit）购自Magen公司，克隆载体（pMDTM18-TVectorCloning Kit)、Es c h e r i c h i a c o l i D H 5感受态细胞、Ex Taq聚合酶和反转录试剂盒（PrimeScriptTM RTMasterMix)购自宝生物工程（大连）有限公司，荧光定量PCR酶（THUNDERBIRD?ProbeqPCR Mix)购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，核酸纯化回收试剂盒（QIAquickGelExtractionKit）、质粒DNA提取试剂盒（QIAGENPlasmid MiniKit)购自德国QIAGEN公司。序列测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。PCR仪（T100 Thermal Cycler）、凝胶成像仪（ChemiDoc XRS+System)购自美国BIO-RAD公司，实时荧光定量PCR仪（QuantStudio7Flex）购自美国Applied Biosystems公司，紫外分光光度计（NanoDropOne)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。1.3引物及探针的设计与合成根据GenBank中已发表的NADC34-likePRRSV经典株、流行毒株以及NADC30PRRSV和HP-PRRSV的流行毒株，采用MegAlign软件进行同源性分析，设计ORF5基因上游引物F、下游引物R和探针P（表1)，引物F/R和探针P均由赛默飞世尔科技（中国)有限公司合成。表1NADC34-likePRRSV毒株ORF5基因引物及探针名称引物F引物R探针Pl)注：1探针P的5用FAM标记，3 用TAMRA标记。1.4最佳引物、探针浓度筛选按照RaPureViralRNA/DNAKit说明书对NADC34-likePRRSV样品进行核酸抽提，用Prime-ScriptTMRTMasterMix对核酸进行反转录，再采用矩阵法筛选荧光定量RT-PCR的引物、探针最佳工作浓度。荧光定量 PCR 反应体系(2 0 L):THUNDERBIRD?Probe qPCR Mix 10 L,50X ROX referencedye0.04L,模板4L,20moL/L引物F、2 0 moL/L引物R分别加人0.2/0.4/0.6 L(工作浓度为0.2/0.4/0.6moL/L),20moL/L探针P加人0.1/0.2/0.3L（工作浓度为0.1/0.2/0.3moL/L),ddH,0补足。反应条件：9 510 s；9 510 s，6 0 35s，40 个循环。上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第5期序列（5 3)产物CCAAGGGYAAACTCTATC70bpCCYTCGACCTCAATYTTCTYCTGTCATCATAGAGAAAGGG8实验研究选择获得较低Ct值、较高荧光信号值Rn和扩增效率值的引物和探针工作浓度为最佳工作浓度。1.5探针特异性实验按照 1.4 节的方法，对 NADC34-like PRRSV、NA D C 30-lik e PRRSV、Q YYZ-lik e PRRSV、H P-lik ePRRSV、Re s p PRRSV M LV lik e PRRSV、PED V、T G EV 和CSFV样品进行核酸抽提和反转录，对PCV2和PRV样品进行核酸抽提，再分别以前8 种毒株样品的cDNA和后2 种病毒样品的核酸为模板进行定量RT-PCR反应。荧光定量PCR反应体系中引物及探针工作浓度采用1.4节筛选出的最佳浓度，反应条件同1.4节，重复3次。1.6标准曲线的建立1.6.1标准阳性质粒的构建PCR扩增NADC34-like PRRSV 的 cDNA。PCR反应体系:2 X Premix ExTaq 25 L,引物 F(20 mol/L)、R(2 0 mol/L)均为 0.5 L,cDNA4L,ddH,020L,充分混匀。反应程序:953min;9530 s,58 30 s,7 2 30 s,30 个循环；7 2 5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，按照纯化回收试剂盒QIAquickGelExtractionKit说明书进行回收。按照克隆载体pMDTM18-TVectorCloningKit说明书，将回收产物与克隆载体pMD18-T连接，并将连接产物转化至E.coliDH5感受态细胞中，根据质粒DNA提取试剂盒说明书提取质粒，将疑似阳性的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。1.6.2线性标准曲线的建立对标准阳性质粒进行浓度测定和10 110 1倍比稀释，进行荧光定量RT-PCR检测（方法同1.5节），建立Ct值与模板浓度间线性标准曲线。1.7敏感性与重复性实验将按照10 110 1倍比稀释的标准阳性质粒作为模板，进行荧光定量RT-PCR，检测最低拷贝数，并同时进行常规RT-PCR检测。通过检测两种方法的最低拷贝数来对比荧光定量RT-PCR的敏感性；进行多次批内重复和批间重复实验，并计算变异系数。1.8临床样品检测利用RaPureViralRNA/DNAKit提取57 6 份疑似PRRSV阳性临床样品的核酸，再按照反转录试剂盒PrimeScriptTMRTMasterMix说明书进行反转录，得到cDNA。先用RT-PCR检测方法10 1对样品进行初次检测，将阳性PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序；再使用建立的荧光定量RT-PCR检测方法对测序比对为NADC34-likePRRSV阳性样品进行检测验证。2结果与分析2.1引物、探针的最佳工作浓度反应体系中引物F、引物R及探针P的最佳工作浓度分别为0.4、0.4、0.2 mol/L，该条件下,PCR检测的Ct值较低（表2），且Rn和扩增率值均较高。上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第5期9.实验研究引物工作浓度/(mol L-1)2.2探针的特异性用NADC34-likePRRSVORF5基因特异性鉴别探针分别对10 种猪源性病毒样品的进行荧光定量PCR扩增，只有NADC34-likePRRSV样品扩增产物表现出FAM荧光信号，而NADC30-likePRRSV、QYYZ-like PRRSV、H P-l i k e PRRSV、Re s p PRRSV M LVl i k e PRRSV、PED V、T G EV、CSFV、PCV2 和PRV样品均不表现FAM荧光信号（图1)。2.001.751.501.251.000.750.500.250.040124681012141618 20 2224 2628 303234363840循环数1:NADC34-like PRRSV模板；2 10:NADC30-likePRRSV.QYYZ-like PRRSV、H P-lik e PRRSV.Re s p PRRSV M LV lik e PRRSV、PEDV.TGEVCSFV.PCV2、PRV 模板。2.3标准曲线BLAST比对结果显示：阳性重组质粒扩增序列与IA/2014/NADC34（M F32 6 98 5.1)同源性达到99%以上，表明已成功构建标准阳性质粒pMD18-T-GP5。多次进行荧光定量RT-PCR后发现，标准阳性质粒模板浓度在1.56 10 1 1.56 10 1拷贝/L时，可以得到稳定的扩增曲线，标准曲线见图2,R=0.9995，扩增效率为93.15%。上海畜牧兽医通讯表2 不同引物、探针工作浓度下荧光定量RT-PCR的Ct值探针工作浓度/(molL-1)项目0.10.232.780.423.120.630.68图1十种猪源性病毒荧光定量RT-PCR扩增曲线40.0035.0030.0025.0020.0015.0010.005.0001.56图2NADC34-likePRRSV荧光定量RT-PCR检测的标准曲线2023年第5期0.20.330.2629.5621.4525.4124.1328.62210y=-3.498 7x+41.56R2=0.999 51.561021.561041.561061.561081.561010模板浓度/(拷贝uL-)10实验研究2.4荧光定量RT-PCR检测方法的敏感性敏感性实验结果表明：采用荧光定量RT-PCR进行检测，以1.56 X10拷贝/L标准品为模板，仍可观察到荧光信号（图3）；采用常规RT-PCR进行检测，1.56 10、1.56 10 1拷贝/L的标准品模板均不能检出（图4）。结果表明，荧光定量RT-PCR的敏感性高于常规RT-PCR。1.31.21.11.00.90.80.70.60.50.40.30.20.110.04012468101214161820222426283032343653840循环数110:1.561010、1.56 10%、1.56 10 8、1.56 10 7、1.56 10 6,1.56 10 5、1.56 10 4、1.56 10 3、1.56 10 2、1.56 10 1拷贝/L；11:阴性对照。上海畜牧兽医通讯23图3不同浓度NADC34-likePRRSV模板的荧光定量RT-PCR扩增曲线M123456789102023年第5期468910115000bp3.000bp2 000bp1500bp1000 bp750bp图4不同浓度NADC34-likePRRSV模板的常规RT-PCR扩增产物电泳图表3荧光定量PCR反应的重复性检测结果500bp250bp100bp泳道M：D NA 分子量标准（DL5000)；泳道1 10：模板浓度依次为1.56 10 10、1.56 X10%、1.56 10 8、1.56 10 7、1.56 X10 6 1.56 105、1.56 10 4、1.56 10 3、1.56 X10 2 和1.56 X101拷贝/L。2.5荧光定量RT-PCR检测方法的重复性分别对3个浓度质粒标准品连续进行3次RT-PCR检测，结果显示：批内和批间检测Ct值变异系数均小于0.50%，表明该荧光定量RT-PCR检测方法的重复性与稳定性良好（表3)。质粒浓度/(拷贝L-1)1.561071.56X1051.56X103批内重复性实验Ct 值(SD)变异系数/%14.050.020.1323.200.030.1230.810.090.2811批间重复性实验Ct 值(SD)变异系数/%14.110.050.3923.230.040.1930.880.120.40实验研究2.6临床验证实验结果576份疑似PRRSV阳性样品的普通RT-PCR检测结果显示：144份为NADC30-likePRRSV阳性，132份为NADC34-likePRRSV阳性，46 份为PRRSV阳性，2 0 份为QYYZ-likePRRSV阳性，18 份为HP-likePRRSV阳性。采用建立的荧光定量RT-PCR方法对经常规RT-PCR检测为NADC34-likePRRSV阳性的132 份样品进行检测，均获得荧光信号曲线。3讨论PRRSV为单股正链的RNA病毒，病毒在复制过程中RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependentRNA polymerase,RDRP)缺乏3 到5 的核酸外切酶校正功能，极易导致PRRSV复制过程中发生错误11-12 。国内NADC34-likePRRSV存在复杂的重组模式，NADC34-likePRRSV主要与NADC30-likePRRSV、QYYZ-likePRRSV等发生重组，在非结构蛋白和ORF中均可出现重组位点13-15。NADC34-likePRRSV发生重组后，其毒力和致病性发生较大的变化16-17。目前，还没有NADC34-like PRRSV的有效候选疫苗，盲目地对猪群接种PRRSV疫苗加剧了NADC34-likePRRSV毒株的重组，加快了NADC34-likePRRSV在国内的蔓延。PRRSVORF5基因编码的GP5蛋白被普遍认为是较强的抗原，也容易发生变异18-19,因此ORF5基因常被用作PRRSV分子流行病学监测中基因分型的依据2 0 1。目前，利用常规RT-PCR凝胶电泳检测方法难以将NADC34-like PRRSV与NADC30-like PRRSV毒株进行区分。CHEN等2 1基于NADC30-likePRRSVORF6基因，建立荧光定量RT-PCR检测方法，但因NADC34-likePRRSV与NADC30-likePRRSV在ORF6基因上同源性较高，该检测方法无法鉴别NADC34-likePRRSV与NADC30-likePRRSV；韦天超等人2 2 基于NADC34-likePRRSVORF7基因，建立了荧光定量RT-PCR检测方法，但因PRRSV各毒株类型的ORF7基因相对保守，故该方法对NADC34-like PRRSV毒株的检测特异性较低；袁丽莉等人2 3 基于NADC34-likePRRSVNSP2基因，建立荧光定量RT-PCR检测方法，但因NSP2基因在PRRSV基因组中遗传多样性较高，NSP2是发生缺失、插入和重组频率最高的非结构蛋白，同时，NADC34-like PRRSV的NSP2并不保守2 4-2 5，该方法用于后续变异株检测可能存在一定的挑战。鉴于PRRSV各种毒株类型间的ORF5基因有较高的特异性，同时NADC34-likePRRSV的ORF5基因具有较高的保守性，ORF5基因可以作为NADC34-likePRRSV实时荧光定量RT-PCR的扩增靶点。TU等人2 6 基于NADC34-likePRRSVORF5基因建立的荧光定量RT-PCR检测方法，扩增片段为130 bp，主要用于四川省辖区猪场样品检测。本研究通过比对NCBI中已发表的PRRSV各种类型毒株的主要序列，以及比对大部分NADC34-likePRRSV毒株的序列，选择NADC34-likePRRSVORF5基因为目的基因进行引物和探针设计，通过使用简并碱基优化引物和探针的碱基，并对引物和探针工作浓度进行筛选，确定检测的最佳反应条件，建立荧光定量RT-PCR检测方法；使用标准阳性质粒建立了标准曲线，与常规RT-PCR检测方法相比较，建立的检测方法具有更高的灵敏度、特异性，可用于国内流行的NADC34-like PRRSV毒株检测；该扩增目的片段为7 0 bp，大大缩减了荧光定量RT-PCR检测时间，可避免接触核酸电泳过程中对人体产生危害的试剂，扩增效率较高且重复性好。上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第5期参考文献1J COLLINS J E,BENFIELD D A,CHRISTIANSON W T,et al.Isolation of swine infertility and respiratory syndromevirus(isolate ATCC VR-2332)in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic 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