贝莱斯芽孢杆菌CL-4固态发酵对豆粕营养品质的影响.pdf

山 东 农 业 科 学():./.收稿日期:修回日期:基金项目:年度吉林省科研院所引进高层次科技创新人才资助计划项目吉林省农业科技创新工程基本科研经费项目()作者简介:瞿子惠()女硕士研究实习员从事动物营养与饲料研究:.通信作者:郎洪彦()女硕士副研究员从事动物科学研究:.陈龙()男博士副研究员从事动物营养与饲料科学研究:.贝莱斯芽孢杆菌 固态发酵对豆粕营养品质的影响瞿子惠刘歆郑琳魏炳栋闫晓刚于维陈龙郎洪彦(吉林省农业科学院动物营养与饲料研究所吉林 公主岭)摘要:本试验选用吉林省农业科学院动物营养与饲料研究所分离鉴定的贝莱斯芽孢杆菌 对豆粕进行固态发酵通过对发酵前后豆粕中营养成分、大豆抗原蛋白、酶活力、活菌数、抗菌活性及表观形态等指标的测定评价贝莱斯芽孢杆菌 固态发酵豆粕营养品质的提升效果 结果表明:贝莱斯芽孢杆菌 在大豆抗原蛋白筛选平板上显示出较大直径的水解圈具有降解大豆抗原蛋白的能力 固态发酵 显著提高了豆粕营养品质和功能代谢产物具有更高浓度的酸溶蛋白、钙、灰分和总磷含量其中粗蛋白含量由.增加到.总氨基酸含量由.显著提高至.半纤维素含量从.下降到.纤维素含量由.降低到.大豆球蛋白和 伴球蛋白的降解率可达.和.综上贝莱斯芽孢杆菌 作为发酵豆粕的新型菌种资源可有效降解豆粕中抗营养因子提高豆粕营养品质和饲料效率关键词:贝莱斯芽孢杆菌固态发酵豆粕营养品质中图分类号:.文献标识号:文章编号:()().豆粕是食品和饲料领域常见的优质植物性蛋白来源 豆粕中主要的抗原蛋白是大豆球蛋白和伴球蛋白分别占豆粕总蛋白的 和 左右 当幼龄仔猪摄入这类蛋白质时会引起过敏导致吸收不良综合征、生长抑制和腹泻 此外豆粕中还含有非淀粉多糖主要由纤维素、半纤维素和果胶组成被证实是导致断奶仔猪肠道疾病的诱因 发酵豆粕通过添加有益微生物如少孢根霉()、米曲霉()、短乳杆菌()或枯草芽孢杆菌()可以有效去除部分对动物有害的抗营养因子从而改善豆粕营养品质提高动物消化利用率贝莱斯芽孢杆菌()作为芽孢杆菌中新划分的一个种于 年与.、.、.重新归类并命名为.有关.的研究集中于生物防治和促进植物生长等方面 贝莱斯芽孢杆菌于 年被列入欧盟安全资格认定()推荐的生物制剂列表中可作为新型发酵饲料菌种有关.在畜禽应用的报道逐渐增多主要集中在饲料霉菌毒素玉米赤霉烯酮()和黄曲霉毒素()脱毒和水产益生菌方面 本研究团队主要开展有关.在木质纤维素利用方面的研究前期成功分离并鉴定一株来自鸡盲肠内容物的.具有富产木质纤维素酶优势同时具有抑制病原细菌和真菌的能力对动物安全无毒具有良好的益生特性 现已完成了该菌株的全基因组测序并成功用于发酵玉米胚芽粕获得授权发明专利一株禽源贝莱斯芽孢杆菌及其应用(专利号:.)豆粕常用发酵菌多为枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌等仅有少数文献报道了贝莱斯芽孢杆菌发酵豆粕的应用 因此本研究利用.发酵豆粕探究发酵前后豆粕中抗营养因子、营养成分、微生物、酶活力以及表观形态等变化旨在为生物蛋白饲料提供新型优良菌种为进一步改善发酵豆粕营养品质提供理论依据和数据支撑 材料与方法.试验材料.菌株和发酵原料菌种贝莱斯芽孢杆菌(.)分离自肉鸡盲肠内容物病原指示菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 均由吉林省农业科学院动物营养与饲料研究所保存豆粕购自吉林省公主岭禾丰牧业有限责任公司.主要试剂和仪器 试剂、培养基、大豆球蛋白和 伴球蛋白 试剂盒购自北京龙科方舟生物工程技术有限公司植物蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物有限公司 控摇床恒温培养箱高压灭菌锅超净工作台.试验方法.豆粕抗原蛋白平板制备及菌株降解能力测定 抗原蛋白培养基的制备:称取 豆粕磨碎后过 目筛加入 .的 缓冲液 、/振荡 /离心 沉淀再浸提一次合并两次上清液 向上清液中加入 至./用/调 至.沉淀过夜 于 /、离心 得到大豆球蛋白沉淀 上清液加 至./调 至.室温搅拌 /、离心 上清液稀释 倍调 至./离心 得到 伴球蛋白沉淀 将所有沉淀溶于 调 至.加入.(/)琼脂 灭菌 抗原蛋白平板制备:在灭菌培养皿中加入 抗原蛋白培养基待冷却后再加入营养培养基(蛋白胨 /、牛肉膏 /、氯化钠 /、琼脂 /高压灭菌 )冷却至凝固待培养基表面无明显水迹后将已灭菌的牛津杯置于试验平板中轻轻加压使其与培养皿接触无空隙保存备用菌株降解豆粕抗原蛋白能力测定:根据 山 东 农 业 科 学 第 卷 等的 方 法 制 备 候 选 菌 株.粗上清液过.微孔滤膜 取 粗上清液加入抗原蛋白筛选平板的牛津杯中培养 以添加 生理盐水为对照 若菌株对抗原蛋白有降解作用即可见到水解圈 根据水解圈直径与牛津杯孔径比值测定.的豆粕抗原蛋白降解能力.发酵豆粕的制备 将.在 液体 培养基中培养 以备固态发酵将豆粕 高压灭菌处理 称取灭菌后的豆粕 于 烧瓶中发酵菌种添加量为/最终含水量为 搅拌均匀后用滤菌呼吸膜封住瓶口于 下发酵 然后、阻断发酵 以.无菌生理盐水为对照重复 次 将发酵样品 烘干 冷却研磨过 目筛用于 和营养成分分析.值和发酵代谢产物相关指标测定准确称取、的发酵样品各.溶于.蒸馏水中室温/振荡 静置 后测定 值采用倍比稀释法测定发酵样品中活菌数通过 法测定纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力中性蛋白酶活力测定参考行业标准/使用琼脂扩散法测定发酵后豆粕的抑菌性以金黄色葡萄球菌 和大肠埃希菌 作为抑菌试验的指示剂.营养成分分析 根据()测定发酵前后豆粕中干物质、粗纤维、粗蛋白、纤维素、半纤维素、总磷、钙和灰分等含量 根据 等的方法测定发酵前后豆粕中酸溶蛋白含量采用氨基酸自动分析仪测定发酵前后豆粕中氨基酸含量.豆粕抗原蛋白定量检测利用间接竞争性 法测定发酵前后豆粕中大豆球蛋白和伴球蛋白含量采用北京龙科方舟试剂盒进行.分析根据植物蛋白提取试剂盒说明书提取发酵、豆粕可溶性蛋白使用 蛋白定量试剂盒将上清液定量至 /分别配制分离胶和浓缩胶采用稳流 电泳至蛋白进入分离胶然后设定稳流 电泳至溴酚蓝离胶底 最后采用考马斯亮蓝染色和脱色液脱色直至凝胶背景脱净.扫描电镜观察取发酵前后豆粕样品.包裹于滤纸内用.戊二醛 浸泡过夜扫描电镜观察倍数分别为 、.数据统计与分析使用 软件(.)通过 和单因素方差分析()对数据进行统计分析各组间数据显著差异水平设定为.数值表示为平均值标准差 结果与分析.降解豆粕抗原蛋白能力测定如图 所示.胞外上清液在大豆抗原蛋白筛选板上显示出较大直径水解圈而生理盐水对照没有出现水解圈初步推断.胞外上清液具有降解大豆抗原蛋白的能力 和 为生理盐水对照 和 为.胞外上清液图 .降解豆粕抗原蛋白能力.豆粕发酵前后营养成分比较分析如表 所示与发酵前相比.固态发酵 后豆粕干物质含量由.下降至.粗蛋白含量由.增加到.酸溶蛋白含量由.显著提升至.钙、灰分和总磷含量均有所提高 粗纤维含量显著降低其中半纤维素含量从.下降到.纤维素含量由.降低到.各种氨基酸含量均呈上升趋势除精氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、酪氨酸和脯氨酸外其他必需和非必需氨基酸显著提升(.)与原始豆粕相比固态发酵饲料的总氨基酸含量由.显著提高至 第 期 瞿子惠等:贝莱斯芽孢杆菌 固态发酵对豆粕营养品质的影响.因此.固态发酵可显著提高豆粕营养品质降低粗纤维含量 表.发酵前后豆粕营养成分分析成分原始豆粕发酵豆粕干物质.粗蛋白.酸溶蛋白.粗纤维.纤维素.半纤维素.灰分.钙.总磷.必需氨基酸精氨酸.组氨酸.异亮氨酸.亮氨酸.赖氨酸.蛋氨酸.苯丙氨酸.苏氨酸.缬氨酸.非必需氨基酸天冬氨酸.丝氨酸.谷氨酸.甘氨酸.丙氨酸.半胱氨酸.酪氨酸.脯氨酸.总氨基酸含量.注:同行数据肩标不同大、小写字母分别表示差异极显著(.)、显著(.)下同.发酵豆粕抗菌活性图 显示与未发酵豆粕的上清液相比固态发酵 后的豆粕上清液在 固体培养基上对金黄色葡萄球菌 和大肠埃希菌 具有明显的抑菌圈 因此.固态发酵豆粕具有一定的抗菌活性.发酵豆粕 值、活菌数及酶活力变化由表 可知与发酵前相比.固态发酵豆粕的活菌数从(.)/显著增加到(.)/值从.小幅增加到.纤维素酶活力由(.)/提升至(.)/木聚糖酶活力由(.)/提升至(.)/果胶酶活力由(.)/上升至(.)/甘露聚糖酶活力由(.)/提升至(.)/中性蛋白酶活力由(.)/提升至(.)/各种酶活力均显著提高、为.胞外上清液重复图 .固态发酵豆粕的抗菌活性 表.发酵豆粕 值、活菌数及酶活力变化项目原始豆粕发酵豆粕 值.活菌数/(/).纤维素酶活力/(/).木聚糖酶活力/(/).果胶酶活力/(/).中性蛋白酶活力/(/).甘露聚糖酶活力/(/).发酵豆粕抗原蛋白降解效果 分析结果(图)显示在 发酵过程中豆粕分子量大于 的蛋白亚基逐步降解而 的蛋白含量逐渐提高 大豆抗原蛋白亚基中的 伴球蛋白亚基(和)分子量在 左右发酵 基本降解、分别代表发酵、图 .发酵豆粕可溶性蛋白分子量变化 山 东 农 业 科 学 第 卷而 伴球蛋白 亚基分子量为 左右于 被降解 因此.固态发酵可将豆粕中大分子抗原蛋白降解成小分子肽类 定量检测结果(表)显示与发酵前相比.固态发酵 后豆粕中大豆球蛋白含量由(.)/降低至(.)/降解率可达.伴球蛋白含量由(.)/下降至(.)/降 解 率 可 达.表 明.固态发酵可显著降低豆粕中大豆球蛋白和 伴球蛋白含量.发酵过程中豆粕表观形态变化扫描电镜观察结果(图)显示发酵前豆粕结构紧凑、表面光滑.固态发酵 后豆粕的块状结构被大量分解呈现出碎片、破裂和多纤维素结构表明.固态发酵可明显改变豆粕表观形态有效降解木质纤维素 表.发酵豆粕抗原蛋白的降解效果项目大豆球蛋白含量/(/)降解率/伴球蛋白含量/(/)降解率/原始豆粕.发酵豆粕.注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(.)分别代表原始豆粕放大 、倍 分别代表发酵 豆粕放大 、倍图 .发酵过程中豆粕形态变化 讨论与结论豆粕来源广泛且营养丰富是动物饲料中主要的植物源性蛋白资源 然而豆粕中含有多种抗营养因子限制了其在幼龄动物日粮中的广泛应用 研究表明微生物发酵可以部分降解豆粕中抗营养因子从而改善其营养品质本研究中抗原蛋白平板法测定验证了新型菌种.可降解豆粕抗原蛋白.固态发酵 后豆粕中大豆球蛋白和 伴球蛋白的降解率可分别达.和.由于原料在发酵前已经灭菌且发酵过程也是无菌的不涉及外源或天然微生物影响因而.在豆粕发酵过程中发挥主要作用 测定的豆粕可溶性蛋白分子量变化与酶联免疫吸附法测定的大豆球蛋白和 伴球蛋白在发酵过程中的降解趋势一致 此前研究也在.全基因组序列中检测到丝氨酸蛋白酶、氨基肽酶、金属蛋白酶等多种蛋白水解酶的基因 在酶活力检测中也发现.中性蛋白酶活性显著提高有效分解豆粕中抗原蛋白 等采用两段发酵法通过枯草芽孢杆菌 和粪肠球菌 发酵豆粕和玉米混合底物营养价值显著提高 等发现枯草芽孢杆菌 厌氧发酵豆粕可增加酸溶蛋白()含量最高达到.大 第 期 瞿子惠等:贝莱斯芽孢杆菌 固态发酵对豆粕营养品质的影响豆球蛋白和 伴球蛋白分别降低.和.等发现在玉米豆粕混合饲料中接种枯草芽孢杆菌.和屎肠杆菌.大豆球蛋白和 伴球蛋白的降解率分别为.和.以上研究与本试验结果一致在后续研究中还需要通过 电泳和蛋白质组学对发酵产物中的蛋白质作进一步研究本研究中.固态发酵豆粕与原始豆粕相比含有更高含量的粗蛋白和氨基酸含量与前人的报道一致 发酵过程中干物质的损失也可能导致粗蛋白和氨基酸的增加.可显著提高豆粕中酸溶蛋白含量主要是由于在发酵过程中豆粕抗原蛋白或其他蛋白水解形成小分子肽和游离氨基酸 本研究中.发酵豆粕对金黄色葡萄球菌 和大肠埃希菌 具有一定抑制能力可部分替代饲料中的抗生素本研究中与原始豆粕相比发酵豆粕中纤维素和半纤维素降解率分别为.和.在豆粕发酵过程中几种非淀粉多糖降解酶(纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶)的活力均显著上升 扫描电镜观察发现与原始豆粕相比发酵豆粕表面结构呈现开裂和多孔结构说明其中木质纤维素组分可能被部分降解而这与非淀粉多糖降解酶密切相关 此外随着纤维素和半纤维素的降解豆粕中蛋白组分更容易被.分泌的蛋白酶所分解因此发酵豆粕可能会具有更高的养分消化率目前生物发酵饲料常用的发酵菌种为芽孢杆菌、乳酸菌以及酵母菌 中国生物饲料产业创新战略联盟最新发布并实施的发酵饲料技术通则中明确指出发酵饲料菌种只允许添加饲料添加剂品种目录(年)规定的相应菌种可用菌种约为 种而欧盟食品安全局()可利用的菌种数量可达 余种 因而新型发酵菌种的研发和应用急需开展 贝莱斯芽孢杆菌菌株通常从土壤、植物根际、河流、动物肠道和发酵食品等来源分离获得其相关研究集中于生物防治和促进植物生长等方面 贝莱斯芽孢杆菌已于 年被列入欧盟安全资格认定()推荐的生物制剂列表中可作为新型发酵饲料菌种 全基因组学分析发现.有大量编码木质纤维素降解酶的基因其发酵产生的碳水化合物酯酶、果胶酸裂解酶和碳水化合物结合模块()也可能影响纤维素和半纤维素降解 此外在、和 等.基因组中均发现参与降解纤维素和半纤维素的酶基因 但有关将.应用于动物饲料益生菌和生物发酵饲料中的报道仍然较少本研究通过高产蛋白酶和木质纤维素降解酶的.发酵豆粕可降解豆粕中抗营养因子(大豆抗原蛋白、纤维素和半纤维素)显著改变了原始豆粕的营养特性提高了营养品质和功能代谢物(活菌数、酶活力以及抑菌活性)可作为新型发酵豆粕菌种具有广阔的应用前景参 考 文 献:.():.():.():.().():.():.:.():.:.:山 东 农 业 科 学 第 卷.:.():.:.()():.():.().:.():.():.():.():.():.().():.:.():.:.():.():.:.():.蔡辉益 刘世杰 邓雪娟等.生物饲料团体标准开启产业健康发展新时代.中国畜牧杂志():.():.:.():.:.():.().():.:./.():.:.:.():.第 期 瞿子惠等:贝莱斯芽孢杆菌 固态发酵对豆粕营养品质的影响